Un candidat vaccin sous-unitaire induit une immunité protectrice contre Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis chez la souris

npj Vaccins volume 8, Numéro d'article : 72 (2023) Citer cet article

589 accès

1 Altmétrique

Détails des métriques

Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis (MAP) provoque la paratuberculose (PTB), qui est une entérite granulomateuse chez les ruminants qui menace le développement sain de l'industrie laitière et la sécurité de la santé publique dans le monde entier. Parce que les vaccins inactivés commerciaux ne sont pas complètement protecteurs et interfèrent avec le diagnostic de la tuberculose bovine, nous avons testé quatre protéines de fusion, à savoir 66NC, 66CN, 90NC et 90CN, qui ont été construites avec MAP3527, Ag85B et Hsp70 de MAP dans différentes combinaisons en tandem. Notamment, 66NC, qui code pour une protéine de fusion de 66 kDa qui combine dans un ordre linéaire MAP3527N40–232, Ag85B41–330 et MAP3527C231–361, a induit une réponse IFN-γ puissante et spécifique. L'immunisation de souris C57BL/6 avec la protéine de fusion 66NC formulée dans l'adjuvant Montanide ISA 61 VG a généré des réponses immunitaires robustes de type Th1, Th2 et Th17 et de fortes réponses anticorps. Le vaccin 66NC a protégé les souris C57BL/6 contre l'infection virulente par MAP K-10. Cela a entraîné une réduction de la charge bactérienne et une amélioration des dommages pathologiques dans le foie et l'intestin, en plus d'une réduction de la perte de poids corporel ; une protection significativement meilleure que celle du vaccin 74 F rapporté a également été induite. De plus, l'efficacité du vaccin était corrélée aux taux d'IFN-γ-, de TNF-α- et de lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques à l'antigène sécrétant de l'IL-17A ainsi qu'aux taux sériques d'IFN-γ et de TNF-α après la vaccination. Ces résultats démontrent que la protéine recombinante 66NC est un candidat efficace pour un développement ultérieur dans un vaccin protecteur en termes d'induction d'une protection spécifique contre MAP.

Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis (MAP) provoque la paratuberculose (PTB), communément appelée maladie de Johne, qui est une inflammation granulomateuse à long terme des intestins des ruminants domestiques et sauvages. La perte de poids, une diarrhée sévère et une diminution de la production de lait et de l'état corporel font partie des signes cliniques associés à cette affection au fur et à mesure de son évolution1. La PTB présente une distribution mondiale et une incidence élevée, et elle menace le développement durable et sain de l'industrie laitière2,3. On estime qu'une majorité des troupeaux laitiers américains, environ 90 %, sont infectés par MAP4, entraînant une perte économique annuelle d'environ 250 millions de dollars aux États-Unis3. De plus, MAP a été détecté dans des préparations en poudre pour nourrissons et du lait pasteurisé vendu au détail5,6, et l'agent pathogène a été trouvé dans de nombreuses maladies humaines telles que la maladie de Crohn, le diabète de type I et la thyroïdite de Hashimoto7,8,9, menaçant la santé publique mondiale et sécurité socio-économique.

Malgré la gravité de la TBP chez les ruminants, aucun vaccin efficace n'a été développé. Trois vaccins précédemment utilisés (Mycopar, Silirum et Gudair) sont tous des MAP à cellules entières inactivées formulées dans des émulsions d'huile. Cependant, ces vaccins ne sont pas complètement protecteurs1 et provoquent la formation de granulomes locaux et d'abcès au site d'injection, le principal obstacle probable étant l'interférence avec un test de diagnostic régulièrement utilisé pour la tuberculose bovine et la PTB1,10. Pour tout programme efficace de contrôle de la PTB, le facteur le plus important est de réduire l'excrétion fécale de MAP. Cependant, on a découvert que les vaccins inactivés n'entraînaient qu'une réduction minimale de l'excrétion fécale11,12. Par conséquent, des chercheurs aux États-Unis ont travaillé ensemble dans le cadre du programme intégré de la maladie de Johne et ont utilisé une approche d'inactivation génétique pour développer des vaccins vivants modifiés, qui semblent arrêter l'excrétion fécale de MAP1,10. En effet, les vaccins MAP vivants atténués offrent une meilleure protection mais les interférences potentielles dans les tests de diagnostic de la tuberculose ne sont pas éliminées. De plus, la possibilité d'une exposition humaine par inadvertance à la MAP vivante modifiée est également un problème de santé publique considérable13,14.

Par conséquent, il existe un besoin urgent de vaccins innovants et efficaces contre la TBP qui n'interfèrent pas avec le diagnostic de la tuberculose bovine. Pour résoudre ces problèmes, les chercheurs explorent une gamme de solutions, telles que les vaccins sous-unitaires et les vaccins à base d'ADN. La protéine de choc thermique MAP 70 (Hsp70) est un antigène immunodominant15, et la vaccination recombinante MAP Hsp70 réduit l'excrétion de bactéries dans les fèces pendant une longue période chez les veaux16. Une étude a révélé que le vaccin Hsp70 n'empêche pas la reconnaissance de la tuberculose, et les animaux vaccinés avec Hsp70 se distinguent facilement de ceux infectés par MAP17. Les bovins et les souris infectés par MAP induisent une réponse rapide et forte des lymphocytes T contre les protéines de filtrat de culture en général et les protéines Ag85B en particulier18. Le MAP Ag85B recombinant émulsifié dans l'adjuvant Ribi a induit une réponse immunitaire de type Th1 et Th219. L'antigène Ag85B de MAP a été exprimé dans la luzerne transgénique et a induit une immunité de longue durée chez la souris20. Une protéine de fusion 74 F consistant en MAP3527 et MAP1519 mélangés avec l'adjuvant MPL et un autre vaccin à particules de protéines de fusion contenant des antigènes MAP Ag85A-SOD-Ag85B-74F protégeait efficacement les souris contre l'infection MAP21,22. De plus, une souche atténuée de Salmonella portant les gènes SopE104-Ag85A-SOD-Ag85B et SopE104-74F a provoqué une réponse immunitaire Th1 robuste et persistante caractérisée par la production d'IFN-γ, assurant une protection chez la souris contre le défi MAP23. Pour développer des vaccins sous-unitaires contre la PTB, il est important d'identifier les antigènes mycobactériens qui activent préférentiellement les lymphocytes T CD4+ et CD8+ pour qu'ils prolifèrent et sécrètent l'IFN-γ1,21,24. Des études antérieures ont identifié trois antigènes MAP (MAP3527, Ag85B et Hsp70) dans des conditions d'infection contrôlée chez les moutons, les bovins et les souris caractérisés par leur capacité à induire des réponses des cellules T et des anticorps16,18,21. Dans cette étude, nous avons construit quatre protéines de fusion en combinant en tandem MAP3527, Ag85B et Hsp70 dans différentes combinaisons, nommées 66NC, 66CN, 90NC et 90CN, selon leur poids moléculaire. Nous avons en outre étudié les propriétés immunoprotectrices de ces protéines de fusion dans un modèle murin.

Notamment, les modèles d'infection des ruminants sont largement utilisés pour les études de vaccination contre la PTB24,25. Cependant, en raison de la longue incubation de la maladie chez les ruminants et du coût des expériences, des animaux de laboratoire non ruminants ont été développés pour remplacer les ruminants. Les souris C57BL/6 sont fréquemment utilisées comme modèles pour étudier les infections à MAP et le développement de vaccins21,26,27. Cette étude porte sur l'immunogénicité et l'efficacité protectrice de la protéine de fusion 66NC formulée avec l'adjuvant Montanide ISA 61 VG, qui a été étudiée et comparée à la polyprotéine 74 F dans un modèle murin.

Une représentation schématique de 66NC, 66CN, 90NC et 90CN montrant l'organisation et les sites d'enzymes de restriction (EcoR I et Hind III) utilisés pour construire la protéine de fusion et les données sur la purification de la protéine à l'aide d'une étiquette N-terminale à six histidines sont présentées sur la figure 1a. Les séquences de nucléotides et d'acides aminés de quatre protéines de fusion sont disponibles dans la séquence supplémentaire 1. Les longueurs ORF de 66NC, 66CN, 90NC et 90CN sont de 1902 bp, 1902 bp, 2547 bp et 2547 bp, codant 653 aa, 653 aa, 868 aa et 838 aa, respectivement, avec des masses moléculaires prévues de ~ 66 kDa, ~ 66 kDa, ~ 90 kDa et ~ 90 kDa, respectivement. La protéine recombinante exprimée dans la bobine E. a été purifiée par chromatographie d'affinité sur colonne de Ni (Fig. 1b – d). La purification de la polyprotéine 74 F a été réalisée conformément aux rapports précédents21 et analysée par SDS-PAGE (Fig. 1e).

a Représentation schématique des constructions 66NC, 66CN, 90NC et 90CN. b Purification d'une protéine de fusion 90CN recombinante. ligne M, marqueur de poids moléculaire protéique ; lignée 1, protéine 90CN après renaturation ; ligne 2, écoulement à partir de la résine ; ligne 3, résine liée aux protéines avant lavage ; ligne 4, résine liée aux protéines après lavage ; ligne 5, protéine 90CN purifiée éluée par 500 mM d'imidazole. c Purification d'une protéine de fusion 90NC recombinante. ligne M, marqueur de poids moléculaire protéique ; lignée 1, protéine 90NC après renaturation ; ligne 2, écoulement à partir de la résine ; ligne 3, résine liée aux protéines avant lavage ; ligne 4, résine liée aux protéines après lavage ; ligne 5, protéine 90NC purifiée éluée par 500 mM d'imidazole. d Purification de la protéine de fusion recombinante 66CN et 66NC. ligne M, marqueur de poids moléculaire protéique ; ligne 1, écoulement à partir de la résine ; ligne 2, résine liée aux protéines avant lavage ; ligne 3, résine liée aux protéines après lavage ; ligne 4 et 5, protéine 66CN purifiée éluée par 500 mM et 1 M d'imidazole, respectivement ; ligne 6, résine liée aux protéines après élution ; ligne 7, écoulement à partir de la résine ; ligne 8, résine liée aux protéines avant lavage ; ligne 9, résine liée aux protéines après lavage ; lignes 10 et 11, protéine 66NC purifiée éluée par 500 mM et 1 M d'imidazole, respectivement. e Purification d'une protéine de fusion 74 F recombinante. ligne M, marqueur de poids moléculaire protéique ; ligne 1, écoulement à partir de la résine ; ligne 2, résine liée aux protéines avant lavage ; ligne 3, résine liée aux protéines après lavage ; lignes 4 et 5, protéine 74F purifiée éluée par 200 mM et 500 mM d'imidazole, respectivement. Tous les gels proviennent de la même expérience et ils ont été traités en parallèle.

L'IFN-γ est essentiel dans la lutte contre les agents pathogènes intracellulaires, tels que les mycobactéries28,29. Pour cribler les adjuvants et les voies d'immunisation optimaux, nous avons immunisé des souris par voie sous-cutanée ou intramusculaire avec la protéine de fusion 66NC émulsifiée avec Montanide ISA 61 VG, Montanide GEL 02 PR ou Montanide ISA 206 VG. Trois semaines après la deuxième immunisation, les splénocytes des souris immunisées ont été prélevés pour le test IFN-γ ELISpot (Fig. 2a). L'immunisation sous-cutanée de souris avec 66NC formulé dans l'adjuvant Montanide ISA 61 VG a entraîné la production de la réponse IFN-γ la plus forte après stimulation in vitro de co-cultures de lymphocytes spléniques avec la protéine de fusion 66NC par rapport à celles des 11 autres groupes (Fig. 2b , c). Pour cribler les immunogènes optimaux, nous avons immunisé des souris par voie sous-cutanée avec l'adjuvant Montanide ISA 61 VG mélangé à la protéine de fusion 66NC, 66CN, 90NC ou 90CN. L'immunisation de souris avec 66NC a stimulé la production la plus robuste de réaction IFN-γ contre la protéine de fusion 66NC par rapport aux souris immunisées avec 66CN, 90NC et 90CN (Fig. 2d, e). Les résultats ci-dessus démontrent que la meilleure voie d'immunisation, d'adjuvant et d'immunogène était une injection sous-cutanée, l'adjuvant Montanide ISA 61 VG et la protéine de fusion 66NC, respectivement, qui ont induit une forte réponse IFN-γ spécifique de l'antigène chez les souris C57BL/6.

a Diagramme schématique du calendrier de vaccination. b, c Le test IFN-γ ELISpot a été utilisé pour déterminer l'expression de l'IFN-γ spécifique de l'antigène dans les lymphocytes spléniques de souris immunisées par voie intramusculaire (IM) et sous-cutanée (SC) avec la protéine de fusion 66NC formulée dans différents adjuvants Montanide ISA 206 VG (206 VG ), Montanide ISA 61 VG (61 VG) et Montanide GEL 02 PR (GEL) et stimulés avec l'antigène indiqué, avec l'adjuvant seul comme contrôle négatif. b Images représentatives du test IFN-γ ELISpot (expérience représentative avec au moins trois répétitions indépendantes). c Quantification du test IFN-γ ELISpot. d, e Le test IFN-γ ELISpot a été utilisé pour déterminer l'expression d'IFN-γ spécifique de l'antigène dans les lymphocytes spléniques de souris immunisées par voie sous-cutanée (SC) avec une protéine de fusion (66NC, 66NC, 90NC et 90CN) formulée dans l'adjuvant Montanide ISA 61 VG et stimulée avec l'antigène indiqué, avec l'adjuvant seul comme contrôle négatif. d Photos du test IFN-γ ELISpot (représentatif d'une expérience avec au moins trois répétitions indépendantes). e Quantification du test IFN-γ ELISpot. c, e Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne (SEM). L'ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour analyser la signification statistique, suivie des tests de comparaisons multiples de Tukey. ***P < 0,001.

Les souris ont été immunisées deux fois, à deux semaines d'intervalle, avec 50 μg de 66NC mélangés à de l'adjuvant 61VG par voie sous-cutanée, et la polyprotéine 74 F a été utilisée comme témoin de vaccin sous-unitaire. Trois semaines après la deuxième immunisation, six souris de chaque groupe ont été sacrifiées et l'anticorps anti-66NC, la sécrétion de cytokines et la réponse des lymphocytes T ont été évalués (Fig. 3a). En ce qui concerne les réponses anticorps, les souris immunisées avec 66NC ont montré des réponses IgG1 et IgG2a robustes contre la protéine de fusion 66NC et les niveaux d'anticorps des souris immunisées avec 66NC étaient significativement plus élevés que ceux des souris immunisées avec 74 F (Fig. 3b). Les groupes témoins avec adjuvant seul n'ont présenté aucune réponse spécifique au 66NC.

a Diagramme schématique du calendrier de vaccination. Des souris C57BL/6 ont reçu deux injections sous-cutanées (à trois semaines d'intervalle) avec 50 μg de protéine de fusion 66NC formulée dans l'adjuvant Montanide ISA 61 VG. Les groupes témoins comprennent des souris immunisées avec l'adjuvant Montanide ISA 61 VG seul comme témoin négatif ou l'adjuvant MPL mixte 74 F comme témoin de vaccin sous-unitaire. Trois semaines après l'immunisation de rappel, les souris ont été saignées et sacrifiées. b Les isotypes IgG1 et IgG2a spécifiques de l'antigène ont été mesurés par ELISA. c Images du test IFN-γ et IL-4 ELISpot (représentatif d'une expérience avec au moins cinq répétitions indépendantes). d, e Quantification du test IFN-γ et IL-4 ELISpot. f Le pourcentage de lymphocytes T spécifiques de l'antigène positifs pour les cytokines (%Cyt+) a été quantifié par coloration intracellulaire des cytokines (ICS) dans les CD4+ et CD8+ après stimulation des lymphocytes T spléniques avec l'antigène indiqué. g Les niveaux de cytokines sériques d'IFN-γ, de TNF-α et d'IL-17A ont été mesurés par ELISA. d–g Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne (SEM). L'ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour analyser la signification statistique, suivie des tests de comparaisons multiples de Tukey. **P < 0,01, ***P < 0,001.

Les cellules Th1 produisent des cytokines telles que l'IFN-γ, le TNF-α et l'IL-2, l'IFN-γ étant la cytokine qui caractérise la lignée30. Par rapport aux cellules Th1, les cellules Th2 génèrent de l'IL-4, de l'IL-5 et de l'IL-13, et l'IL-4 est la principale cytokine qui contribue à la transformation des cellules T naïves en cellules Th230. Les réponses immunitaires Th1 et Th2 ont été évaluées par dosage IFN-γ et IL-4 ELISpot. La vaccination 66NC a induit un nombre relatif plus élevé de lymphocytes spléniques exprimant l'IFN-γ et l'IL-4 que la vaccination 74 F ou uniquement la vaccination adjuvante (Fig. 3c – e).

Par la suite, nous avons évalué les réactions des lymphocytes T spécifiques de l'antigène dans la rate par des analyses ICS. Des réponses plus élevées des cellules CD4 + T et CD8 + T sécrétant de l'IFN-γ-, du TNF-α- et de l'IL-17A ont été observées dans la rate des souris vaccinées 66NC par rapport aux souris vaccinées 74 F (Fig. 3f). De plus, les niveaux d'IFN-γ, de TNF-α et d'IL-17A dans les sérums ont été déterminés par ELISA. Les niveaux de ces trois cytokines étaient plus élevés chez les souris immunisées avec 66NC par rapport aux souris immunisées avec 74 F ou n'ayant reçu qu'un adjuvant (Fig. 3g). Ces données suggèrent que les souris vaccinées 66NC ont présenté des réponses immunitaires de type Th1, Th2 et Th17 et de fortes réponses anticorps.

À la sixième semaine, les souris vaccinées ont été provoquées par voie intrapéritonéale avec 109 UFC de MAP K-10 et euthanasiées aux semaines 2, 4, 8 et 12 après la provocation pour évaluer l'efficacité protectrice (Fig. 4a). Au stade clinique de la TBP, les symptômes comprennent une diarrhée persistante, une perte de poids et une émaciation progressive31. Au cours de la période expérimentale, nous avons surveillé le poids corporel des souris vaccinées à 2, 4, 8 et 12 semaines après la provocation. Le gain de poids des souris vaccinées au 66NC était comparable à celui des souris vierges et significativement plus élevé que chez les souris vaccinées au 74F ou à l'adjuvant seul à la semaine 2 suivant la provocation. Ces différences ont persisté aux semaines 4, 8 et 12 (Fig. 4b). Il est suggéré que l'immunité humorale pourrait être bénéfique dans la lutte contre MAP32. Les niveaux d'anticorps dans les sérums aux semaines 2 à 18, mesurés à des intervalles de 2 semaines après l'immunisation, ont été déterminés par ELISA. Les niveaux d'IgG et d'IgM des souris immunisées avec 66NC étaient plus élevés que ceux des souris immunisées avec 74 F ou adjuvant seul, et l'anticorps IgM a été maintenu jusqu'à 12 semaines après la vaccination (Fig. 4c, d). Remarquablement, le titre d'anticorps IgG est resté à un niveau élevé jusqu'à 18 semaines (Fig. 4c). La charge bactérienne (CFU) a été mesurée dans le foie et l'intestin des souris à différents moments après la provocation. Dans le foie, la charge de MAP a été significativement réduite chez les souris vaccinées au 66NC par rapport aux souris vaccinées au 74F ou à l'adjuvant seul 2, 4 et 8 semaines après la provocation (Fig. 4e). Des résultats qualitativement similaires ont été observés dans le foie de souris vaccinées deux semaines après la provocation en utilisant la coloration de Ziehl-Neilsen (Fig. 4g). Les souris vaccinées avec 66NC ont montré des charges de MAP significativement réduites dans l'intestin par rapport aux souris vaccinées avec 74 F ou avec adjuvant seul 2 et 4 semaines après la provocation MAP K-10 (Fig. 4f). Aucune bactérie n'a été cultivée à partir du foie à 12 semaines et de l'intestin à huit semaines et 12 semaines après la provocation.

a Diagramme schématique de la chronologie de la vaccination et de la provocation MAP. Des souris C57BL/6 ont reçu deux injections sous-cutanées (à trois semaines d'intervalle) avec 50 μg de protéine de fusion 66NC formulée dans l'adjuvant Montanide ISA 61 VG (61 VG). Les groupes témoins comprennent des souris immunisées avec l'adjuvant Montanide ISA 61 VG seul comme témoin négatif ou l'adjuvant MPL mixte 74 F comme témoin de vaccin sous-unitaire. Trois semaines après l'immunisation de rappel, les souris ont été provoquées avec MAP K-10 par injection intrapéritonéale. b Le poids corporel a été mesuré pendant 2, 4, 8 et 12 semaines après la provocation MAP (n = 6 par groupe). Surveiller les niveaux d'anticorps IgG (c) et IgM (d). Les sérums ont été collectés et mesurés pour la réponse spécifique des anticorps anti-66NC ou 74F des IgG et IgM à 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 et 18 semaines après la primo-vaccination par ELISA. La quantification de la charge bactérienne a été évaluée dans le foie (e) et l'intestin (f) de souris provoquées par injection intrapéritonéale de MAP K-10 pendant 2, 4 et 8 semaines après la vaccination. g Des images représentatives de la coloration acido-résistante de Ziehl-Neelsen dans le foie de souris vaccinées, deux semaines après avoir été provoquées par MAP, sont présentées (barres d'échelle, 100 μm (en haut) et 10 μm (en bas)). Les images du bas sont agrandies à partir des zones délimitées des images du haut. b, e, f Les données indiquent les résultats cumulés d'au moins trois à six répétitions indépendantes. La moyenne ± SEM et l'ANOVA à deux voies ont été utilisées pour analyser la signification statistique, suivies des tests de comparaisons multiples de Tukey. ns, non significatif ; *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ****P < 0,0001.

La macropathologie et l'histopathologie ont été réalisées sur des échantillons de foie et d'intestins obtenus après autopsie de souris 2 semaines après l'épreuve. De nombreux granulomes à la surface du foie ont été observés chez les souris immunisées avec le 74 F et l'adjuvant uniquement. En revanche, les granulomes étaient moins nombreux et plus petits chez les souris immunisées avec 66NC (Fig. 5a, b, flèche noire). De plus, des macro-granulomes visibles sur l'intestin ont été observés chez les souris immunisées avec 74 F et adjuvant uniquement, tandis que les souris vaccinées 66NC n'avaient aucune pathologie visible (Fig. 5c, d, flèche noire). En ce qui concerne l'histopathologie, les échantillons de foie de souris ayant reçu l'adjuvant seul ont montré de multiples microgranulomes (flèche noire) et de grandes zones focales visibles de nécrose ont entraîné la formation de macrogranulomes (flèche verte).

Pour évaluer la macropathologie, le foie et l'intestin de souris soumises à une injection intrapéritonéale de MAP K-10 pendant deux semaines après la vaccination ont été photographiés. Une image représente une expérience avec au moins cinq répétitions indépendantes. a Modifications macropathologiques du foie. Montanide ISA 61 VG (61 VG) : nombreux macro-granulomes (flèche noire), 66NC : quelques micro-granulomes (flèche noire), 74 F : nombreux macro-granulomes (flèche noire). b Score de macropathologie hépatique. c Modifications macropathologiques de l'intestin. Montanide ISA 61 VG (61 VG) : macro-granulomes (flèche noire), 66NC : pas de pathologie visible, 74 F : macro-granulomes (flèche noire). d Score de macropathologie intestinale. b, d moyenne ± SEM et ANOVA à une voie ont été utilisés pour analyser la signification statistique, suivis des tests de comparaisons multiples de Tukey. ns, non significatif ; *P < 0,05 ; ***P < 0,001.

En revanche, le foie des souris vaccinées 66NC ne présentait que de multiples microgranulomes (flèche noire; Fig. 6a, b). De plus, des macrogranulomes visibles de la séreuse (flèche verte) et de multiples microgranulomes du parenchyme (flèche noire) ont été observés chez les souris vaccinées au 74F. De même, les intestins des souris vaccinées avec adjuvant seul ou 74 F présentaient un macro-granulome sur la surface séreuse (flèche verte). De plus, de nombreuses cellules inflammatoires s'infiltrent dans la musculeuse ou la lamina propria (flèche bleue). En revanche, l'intestin des souris vaccinées 66NC était sans pathologies (Fig. 6c, d). Les résultats ci-dessus suggèrent que la protéine de fusion 66NC formulée dans l'adjuvant Montanide ISA 61 VG a contribué à l'amélioration de la protection des souris C57BL/6 contre MAP K-10 et est meilleure que la protéine de fusion 74 F mélangée dans l'adjuvant MPL.

L'histopathologie a été évaluée dans les coupes de foie et d'intestin colorées à l'hématoxyline et à l'éosine de souris provoquées par injection intrapéritonéale de MAP K-10 pendant 2 semaines après la vaccination. Une image représente une expérience avec au moins cinq répétitions indépendantes. a Modifications histopathologiques dans le foie (barres d'échelle, 200 μm (en haut) et 50 μm (en bas)). Montanide ISA 61 VG (61 VG) : macro-granulomes (flèche verte) et microgranulomes multiples (flèche noire), 66NC : microgranulomes multiples (flèche noire), 74 F : macro-granulomes (flèche verte) et microgranulomes multiples (flèche noire) . Les images du bas sont agrandies à partir des zones délimitées des images du haut. b Score histopathologique du foie. c Changements histopathologiques dans l'intestin (barres d'échelle, 200 μm (en haut) et 50 μm (en bas)). Montanide ISA 61 VG (61 VG) : macro-granulomes (flèche verte) et infiltration cellulaire inflammatoire (flèche bleue), 66NC : sans pathologies, 74 F : macro-granulomes (flèche verte) et infiltration cellulaire inflammatoire (flèche bleue). Les images du bas sont agrandies à partir des zones délimitées des images du haut. d Score histopathologique intestinal. b, d Moyenne ± SEM et ANOVA unidirectionnelle ont été utilisées pour analyser la signification statistique, suivies des tests de comparaisons multiples de Tukey. ns, non significatif ; *P < 0,05 ; **P < 0,01.

Pour étudier la corrélation entre les niveaux de cytokines et la charge bactérienne (CFU) chez les souris après immunisation, nous avons évalué les lymphocytes T sécrétant des cytokines spécifiques de l'antigène (Cyt + ), CD4 + ou CD8 + de la rate et le niveau de cytokines sériques des souris vaccinées à deux semaines après les défis MAP K-10. L'immunisation au 66NC a entraîné des réponses plus élevées des lymphocytes T CD4 + ou CD8 + spécifiques à l'antigène sécrétant de l'IFN-γ, du TNF-α et de l'IL-17A dans la rate que la vaccination au 74 F ou l'adjuvant seul après provocation (Fig. 7a), et des résultats cohérents ont été observés pour le niveau d'IFN-γ et de TNF-α dans le sérum de souris immunisées contre MAP K-10 ; cependant, malheureusement, l'IL-17A n'a pas été détecté dans le sérum (Fig. 7c). Parmi IFN-γ- (P = 0,00033 ou P = 0,029), TNF-α- (P = 0,0039 ou P = 0,005), IL-17A- (P = 0,02 ou P = 0,13) et IFN-γ + TNF- α + IL-17A- (P = 0, 00042 ou P = 0, 0075) sécrétant des cellules T CD4 + ou CD8 + spécifiques de l'antigène dans la rate en corrélation avec la diminution de la charge bactérienne dans le foie (Fig. 7b) et le niveau d'IFN-γ (P = 0, 012), TNF-α ( P = 0, 00071) et IFN-γ + TNF-α ( P = 0, 0047) dans le sérum étaient également corrélés à une diminution de la charge bactérienne dans le foie (Fig. 7d). Des résultats cohérents ont également été observés dans l'intestin (Fig. 1 supplémentaire), suggérant l'importance de l'IFN-γ, du TNF-α et de l'IL-17A pour la protection contre la MAP.

a Pourcentage de lymphocytes T CD4+ et CD8+ spléniques positifs pour les cytokines (Cyt+), mesuré par coloration intracellulaire des cytokines deux semaines après la provocation MAP des souris vaccinées avec l'antigène indiqué. b Corrélation de Pearson (R) des lymphocytes T Cyt+ CD4+ et CD8+ avec les UFC dans le foie après provocation. c Les niveaux de cytokines sériques de l'adjuvant Montanide ISA 61 VG (61 VG) et des souris vaccinées (66NC et 74 F) ont été évalués 2 semaines après avoir été provoqués par MAP K-10. d Corrélations de Pearson des niveaux de cytokines avec les UFC dans le foie après provocation par l'IFN-γ et le TNF-α. Données représentatives d'une expérience avec au moins cinq répétitions indépendantes, moyenne ± SEM. L'ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour analyser la signification statistique, suivie des tests de comparaisons multiples de Tukey. ns, non significatif ; *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001.

Le développement de vaccins sous-unitaires à protéines recombinantes composés de compositions clairement définies produites par des systèmes d'expression hétérogènes a reçu une attention croissante ces dernières années33,34. Un vaccin sous-unitaire ne peut pas se répliquer dans le corps et est donc considéré comme plus sûr35. Du point de vue de la compatibilité, un vaccin sous-unitaire idéal n'interférerait pas avec le diagnostic de la maladie par les tests actuels. Il a été découvert que plusieurs protéines MAP induisent différents niveaux de protection contre l'infection chez les animaux de laboratoire19,36,37. Les rapports suggèrent qu'un mélange d'antigènes recombinants est préférable pour le développement de vaccins. Cependant, le coût de préparation et d'utilisation d'un tel vaccin pour les bovins ou les ovins peut être trop élevé. Pour résoudre ce problème, des protéines de fusion sont construites et testées pour leur capacité à fournir une protection immunitaire contre MAP en utilisant un modèle murin. Une protéine de fusion, 74 F de MAP, avec un adjuvant monophosphoryl lipide A (MPL) et bromure de diméthyl octadécyl ammonium (DDA) s'est avérée protéger les souris et les chèvres, respectivement21,24. Inspirés par le succès de cette protéine de fusion, nous avons construit quatre protéines de fusion en utilisant les gènes map3527, ag85b et hsp 70 de MAP (Fig. 1a). Les coûts des vaccins vétérinaires sont un sujet essentiel, et l'utilisation d'immunostimulants coûteux, tels que le DDA et le MPL, pour la production à grande échelle de vaccins pour animaux serait prohibitive. Dans cette étude, nous avons proposé d'utiliser un adjuvant à base d'huile minérale (Montanide ISA 61VG et Montanide ISA 206 VG) et un adjuvant à base d'eau (Montanide GEL 02 PR) comme adjuvants dans les vaccins sous-unitaires car ils peuvent induire à la fois des réponses immunitaires humorales et cellulaires spécifiques, et sont largement utilisé dans la recherche sur les vaccins chez les bovins, les ovins et les souris38,39,40,41. Bien que non absorbables et fortement irritants, qui sont des inconvénients, les adjuvants à base d'huile peuvent protéger l'antigène d'une dégradation rapide par les enzymes et l'émulsion augmente la persistance de l'antigène pour induire des réponses immunitaires soutenues38.

L'IFN-γ est une cytokine majeure déclenchée lorsque les bovins sont infectés par MAP42, et des études ont montré qu'une expression accrue de l'IFN-γ chez les agneaux immunisés avec des vaccins à ADN peut les protéger de l'infection par MAP37. Dans la présente étude, nous avons immunisé des souris avec les quatre protéines de fusion (66NC, 66CN, 90NC et 90CN) en combinaison avec différents adjuvants. Grâce à l'utilisation d'un crible IFN-γ ELISpot, nous avons identifié la combinaison la plus efficace d'immunogène (66NC) et d'adjuvant Montanide ISA 61VG. Nous avons observé que les souris vaccinées avec la protéine de fusion 66NC formulée avec l'adjuvant 61VG présentaient une réponse IFN-γ spécifique de l'antigène significativement plus élevée que celles immunisées avec l'adjuvant seul ou la protéine de fusion 74F. On pense que les réponses immunitaires à médiation cellulaire sont les plus efficaces pour éliminer les agents pathogènes intracellulaires, y compris les mycobactéries, et fournir une protection43. Cependant, la recherche a indiqué qu'un vaccin comprenant plusieurs composants, qui induit à la fois des réponses immunitaires médiées par les lymphocytes T et B, est plus efficace pour protéger contre Mycobacterium tuberculosis (MTB) H37Rv qu'un vaccin sous-unitaire qui ne stimule que l'immunité des lymphocytes T44. L'étude actuelle a révélé que les souris immunisées avec la protéine de fusion 66NC avaient une réponse IL-4 spécifique de l'antigène plus prononcée et une réponse anticorps plus forte que celles immunisées avec l'adjuvant seul ou le 74 F. activation de l'inflammasome, facilitant la destruction par les macrophages du MTB45 intracellulaire. De plus, une forte réponse IgG1 initiale après la vaccination des moutons était cruciale pour prévenir l'infection à MAP32. Bien qu'une réponse Th1 générée après la vaccination par le BCG n'indique pas toujours une protection46, l'IL-4, une cytokine Th2, a été associée à la défense contre les mycobactéries47. Dans l'ensemble, il a été observé que la protéine de fusion 66NC provoque des réponses immunitaires à médiation cellulaire et humorale spécifiques à l'antigène, ce qui pourrait être un facteur important de protection contre la MAP.

Aux stades initiaux de l'infection à MAP, les lymphocytes CD4+ stimulent l'IFN-γ, activent les macrophages de manière classique (M1), libèrent des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α, l'IL-1β et l'IL-6 et renforcent l'activité microbicide48, 49,50. Au cours de l'infection par MAP, les lymphocytes T cytotoxiques CD8+ jouent un rôle crucial dans l'élimination de MAP1 intracellulaire. Nous avons constaté que les réponses des lymphocytes T CD4 + ou CD8 + spécifiques à l'antigène sécrétant l'IFN-γ et le TNF-α étaient associées à une protection chez les souris C57BL / 6 après avoir été immunisées et provoquées pendant deux semaines. De plus, des résultats similaires ont été observés au niveau de l'IFN-γ et du TNF-α dans le sérum de souris immunisées contre la MAP. Nous avons également observé que les réponses des lymphocytes T CD4+ ou CD8+ spécifiques à l'antigène sécrétant de l'IL-17A après la vaccination étaient corrélées à l'immunoprotection chez les souris C57BL/6 deux semaines après la provocation. Les preuves suggèrent que la sécrétion d'IL-17, qui peut être en partie attribuée aux cellules gamma-delta T (γδT) et aux cellules lymphoïdes innées du groupe 3 (ILC3), peut améliorer la capacité phagocytaire et la présentation de l'antigène51,52. Suite à la vaccination avec un vaccin MTB ΔLprG atténué, l'augmentation des niveaux d'IL-17A dans le sérum a été associée à une diminution de la charge bactérienne dans les poumons après la provocation MTB53. L'analyse du vaccin inactivé Silirum a révélé qu'il n'y avait pas de différence statistiquement significative dans les niveaux de transcription de l'IL-17A entre les chèvres vaccinées et non vaccinées par des macrophages dérivés de monocytes54. Notre étude a révélé que le sérum des souris immunisées avec 66NC avait un niveau significativement plus élevé d'IL-17A par rapport aux groupes non immunisés et 74 F immunisés. Malgré l'incapacité à détecter l'IL-17A dans le sérum deux semaines après la provocation, des réponses des lymphocytes T CD4+ ou CD8+ spécifiques de l'antigène qui sécrètent l'IL-17A pouvaient encore être observées. La principale explication à cela est qu'il a été observé que l'IL-17 était réduite dans les PBMC des chèvres infectées par MAP28 et des bovins avec une infection subclinique de MAP55. De plus, la sécrétion de la cytokine IL-17A peut diminuer chez les souris immunisées contre l'infection MAP, mais la sensibilité à la concentration du test ELISA est limitée.

En l'absence de symptômes cliniques, le gold standard pour évaluer les effets protecteurs des vaccinations MAP est la pathologie et la charge bactérienne des tissus56,57. Par conséquent, pour évaluer l'efficacité protectrice du 66NC, nous avons choisi le foie et l'intestin comme organes d'évaluation, car ceux-ci se sont révélés être des indicateurs fiables de l'état infectieux des souris après la provocation avec MAP dans des études antérieures26,58. Deux semaines après la provocation, une réduction du nombre d'UFC dans le foie et l'intestin a été observée, impliquant l'élimination de MAP. De plus, la protéine de fusion 66NC a réussi à réduire les dommages pathologiques et la quantité de bactéries acido-résistantes dans le foie des animaux vaccinés. Les ruminants souffrant de TBP souffrent de diarrhée et d'une réduction drastique du poids corporel59,60. Nous avons mesuré le poids corporel des souris vaccinées 66NC après la provocation. Le poids corporel des souris immunisées avec 66NC est resté comparable à celui des souris vierges, contrairement au poids corporel des souris immunisées avec 74F et le groupe adjuvant, qui a diminué à des degrés divers. En conclusion, l'immunisation avec 66NC s'est avérée significativement plus efficace pour protéger les souris contre l'infection par MAP que le vaccin 74 F, comme en témoigne la charge de MAP considérablement réduite dans les organes, l'amélioration de la pathologie hépatique et intestinale et le maintien du poids corporel.

En résumé, la vaccination avec la protéine de fusion 66NC a entraîné un contrôle bactérien, atténué les dommages pathologiques dans le foie et l'intestin et réduit la perte de poids corporel après la provocation MAP K-10 dans C57BL/6. Une corrélation a été observée entre la protection et la sécrétion d'IFN-γ, TNF-α et IL-17A par les lymphocytes T CD4 + et CD8 + spécifiques de l'antigène dans la rate des souris après la provocation. De plus, les taux sériques d'IFN-γ et de TNF-α après immunisation étaient liés à l'efficacité protectrice. De plus, les souris immunisées avec 66NC démontrent un effet protecteur plus important contre MAP K-10 que celles immunisées avec 74 F. Les caractéristiques distinctes des antigènes dans le vaccin à protéine de fusion le rendent peu susceptible d'interférer avec le test cutané de la tuberculose bovine chez les bovins ou les moutons. Des recherches supplémentaires sur des espèces telles que les bovins ou les ovins sont nécessaires pour déterminer si le vaccin sous-unitaire de la protéine de fusion 66NC peut protéger contre la PTB sans provoquer de réactions au test cutané de la tuberculose bovine.

Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis K-10 a été cultivée dans du milieu Middlebrook 7H9 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ou du milieu Middlebrook 7H10 (BD Biosciences) additionné de 0,05 % de Tween 80 (Amresco, Solon, OH, USA), 0,2 % glycérol (Sigma-Aldrich, Shanghai, Chine), 10 % d'acide oléique-albumine-dextrose-catalase (OADC, BD Biosciences) et 2 mg/L de mycobactine J (Allied Monitor, Fayette, MO, USA) à 37 °C. Des souris C57BL/6 femelles âgées de six semaines ont été achetées chez Liaoning Changsheng Biotechnology Co. Ltd (Liaoning, Chine). Toutes les expérimentations animales ont été conçues pour minimiser le nombre d'animaux utilisés, et des efforts ont été faits pour minimiser à la fois la détresse et la douleur. Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique animale de l'Institut de recherche vétérinaire de Harbin, en Chine (numéro d'approbation du comité d'éthique HVRI-IACUC-200723-01).

66NC a été généré par la connexion continue en tandem avec les cadres de lecture ouverts (ORF) de la partie N-terminale d'environ 18,9 kDa de MAP3527 (résidus 40–232, 193 aa) à ~30,8 kDa d'Ag85B sans le peptide signal (résidus 41–330, 290 aa, avec le codon stop omis), suivi à l'extrémité C-terminale du fragment C-terminal d'environ 13,0 kDa (résidus 231–361, 131 aa, avec le codon stop omis) de MAP3527. De plus, 66NC comprend un seul ORF organisé dans l'ordre linéaire MAP3527N40–232-Ag85B41-330–MAP3527C231–361 ; 66CN a été généré par les ORF en tandem du MAP3527C231–361 vers l'Ag85B suivi du MAP3527N40–232, à partir de l'ORF MA3527C231–361-Ag85B41–330-MAP3527N40–232.

90NC, qui comprend l'ORF pleine longueur de Hsp70 (sans codon d'arrêt) au lieu de Ag85b, est codé par l'ORF MA3527N40–232-Hsp70-MAP3527C231–361. De même, 90CN inclut le Hsp70 au lieu de Ag85b, mais il est codé par l'ORF MA3527C231–361-Hsp70-MAP3527N40–232.

Les gènes map3527N40–232 et map3527C231–361 ont été amplifiés à partir du génome de MAP K-10 à l'aide de l'ADN polymérase PrimeSTAR Max (TaKaRa Bio, Pékin, Chine) et des amorces MAP3527N-F/R et MAP3527C-F/R, respectivement (Supplementary Tableau 1). La procédure de réaction PCR est la suivante pour la fabriquer. Pré-dégénérescence à 98 °C pendant 5 min, dégénérescence à 98 °C pendant 10 s, recuit à 65 °C pendant 15 s, extension à 72 °C pendant 10 s, avec 30 cycles, puis extension finale à 72 °C pendant 1 minute. Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide du kit de purification PCR (TIANGEN, Pékin, Chine). Ils ont ensuite été ligaturés séparément dans le vecteur pET28a (Novagen, Darmstadt, HE, Allemagne), qui avait été double digéré par Nde I et EcoR I, en utilisant le kit de clonage Trelief SoSoo (TSINGKE, Pékin, Chine) à 50 ° C pour 15 min. Les produits ligaturés ont ensuite été transformés dans Escherichia coli (E. coli) DH5α et les colonies avec les bons plasmides, qui ont été nommées pET28a-MAP3527N et pET28a-MAP3527C, ont été déterminées par PCR et séquençage d'ADN. Ensuite, les gènes map3527N40–232 et map3527C231–361 ont été à nouveau amplifiés à l'aide des amorces MAP3527NN-F/R et MAP3527CC-F/R, respectivement (tableau supplémentaire 1) et ligaturés dans les pET28a-MAP3527C et pET28a-MAP3527N, qui avaient été double- digéré par Hind III et Xho I, en utilisant le kit de clonage Trelief SoSoo. Enfin, les produits ligaturés ont été identifiés par PCR et vérifiés par séquençage d'ADN et ont été nommés pET28a-MAP3527N-MAP3527C et pET28a-MAP3527C-MAP3527N.

Les gènes ag85b (sans séquence de peptide signal 1–40 aa) et hsp70 ont été amplifiés en utilisant le génome MAP K-10 comme matrice avec Ag85BNC-F/R, Ag85BCN-F/R, Hsp70NC-F/R et Hsp70CN-F /R, et sous-clonées dans les constructions pET28a-MAP3527N-MAP3527C et pET28a-MAP3527C-MAP3527N, qui ont été digérées deux fois par EcoR I et Hind III, à l'aide du kit de clonage Trelief SoSoo. Après la ligature, les produits ont été transformés dans E. coli DH5α, et les transformants contenant l'insert et l'orientation corrects ont été vérifiés par PCR et confirmés par séquençage d'ADN. Les constructions finales, codant pour les protéines de fusion de 66 kDa (66NC et 66CN) et 90 kDa (90NC et 90CN), comprennent un seul ORF organisé dans les ordres linéaires suivants : MAP3527N-Ag85B-MAP3527C, MA3527C-Ag85B-MAP3527N, MA3527N-Hsp70- MAP3527C et MA3527C-Hsp70-MAP3527N.

Le plasmide recombinant a été exprimé dans la souche E. coli BL21 (DE3) dans du milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine. Une culture d'une nuit de BL21 contenant un plasmide recombinant a été ajoutée à 1 L de milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine et cultivée à 37 °C sous agitation. Les cultures ont été induites à une DO600 nm de 0, 6 à 0, 8 avec 1 mM d'isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) pendant 4 h à 37 ° C, 350 × g. Les cellules bactériennes induites ont été récoltées et soniquées avec du tampon A (20 mM Tris-HCl-150 mM NaCl-10% glycérol-pH 8,0) et centrifugées à 33 264 × g pendant 10 min. Les culots ont été dissous dans du tampon A contenant 0,5 % de lauroyl sarcosine sodique, puis dialysés pendant 24 h contre du tampon A contenant du glutathion oxydé 0,1 mM et du glutathion réduit 0,9 mM. La protéine qui a subi une dialyse a ensuite été centrifugée à une vitesse de 33 264 × g pendant 30 min, et le surnageant a été chargé sur une résine Ni-NAT (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Suède). Chaque protéine cible a été éluée avec un tampon d'élution (Tris-HCl 20 mM-NaCl 150 mM-glycérol 5 %-imidazole 500 mM-pH 8,0). Chaque protéine purifiée a été soumise à un kit d'élimination d'endotoxines ToxinEraser (Genscript, Nanjing, Chine) pour éliminer l'endotoxine et confirmée par analyse par spectrométrie de masse.

La procédure de construction du 74 F a été évoquée dans les rapports précédents21. De brèves descriptions sont incluses ci-dessous. Le produit du gène MAP3527C183–361 correct a été ligaturé dans le vecteur pET17b, suivi de la ligature du produit MAP1519N1–460 dans le pET17b-MAP3527C183–361. Enfin, le produit MAP3527N33–180 a été ligaturé dans le pET17b-MAP3527C183–361-MAP1519N1–460. Le plasmide recombinant (pET17b-MAP3527C183–361-MAP1519N1–460-MAP3527N33–180) a été analysé par séquençage et a été transformé dans E. coli BL21 en milieu LB contenant 100 µg/mL d'ampicilline. L'expression et la purification du 74F ont été réalisées selon les méthodes décrites ci-dessus. La confirmation de la protéine 74 F purifiée a été obtenue grâce à l'utilisation d'une analyse par spectrométrie de masse.

Trente-six souris ont été immunisées (par groupes de trois) avec 50 μg de la protéine de fusion 66NC mélangée avec Montanide ISA 61 VG (eau-dans-huile, Seppic, Paris, France), Montanide ISA 206 VG (eau-dans-huile -dans l'eau, Seppic), ou des adjuvants Montanide GEL 02 PR (adjuvant à base d'eau, Seppic) dans une solution protéique ou PBS : rapport volumique d'adjuvant de 1:1,5, respectivement. Le même volume de PBS a été mélangé séparément avec les trois adjuvants ci-dessus en tant que témoin négatif. Les six groupes mentionnés ci-dessus ont été vaccinés en utilisant deux voies d'immunisation. Chaque groupe a été administré deux fois, à trois semaines d'intervalle, dans un volume total de 100 μL. Dix-huit souris ont reçu une injection intramusculaire (IM) dans la cuisse et dix-huit autres souris ont reçu une injection sous-cutanée (SC) dans le dos (tableau supplémentaire 2). Quinze souris ont été immunisées (par groupes de trois) avec un volume total de 100 μL avec l'adjuvant Montanide ISA 61 VG plus 50 μg de protéine de fusion 66NC, 66CN, 90NC ou 90CN ou de PBS par injection SC à une solution de protéine ou de PBS : adjuvant rapport volumique de 1:1,5, respectivement.

Tous les animaux de chaque groupe ont été euthanasiés par inhalation de CO2 trois semaines après la deuxième immunisation, et les lymphocytes ont été isolés de la rate à l'aide du kit de milieu de séparation des lymphocytes de rate de souris (TBD Science, Tianjin, Chine) conformément aux instructions du fabricant pour IFN-γ ELISpot essai. Les détails de la procédure sont les suivants. La rate de souris a été séparée de manière aseptique à l'aide de ciseaux, coupée en petits morceaux et broyée dans le liquide de rinçage de l'homogénat (TBD Science). La suspension unicellulaire a été obtenue à travers un tamis de 70 mesh, puis centrifugée à 350 × g pendant 10 min et les surnageants ont été jetés. Toutes les cellules tissulaires ont été remises en suspension dans un diluant d'échantillon de tissu (TBD Science), puis ajoutées à la surface du milieu de séparation des lymphocytes (TBD Science). Les lymphocytes spléniques ont été obtenus par centrifugation à 400 xg pendant 30 min puis lavés avec une solution de lavage (TBD Science) et purifiés en éliminant les cellules adhérentes.

Quatre-vingt-seize souris ont été séparées au hasard en quatre groupes et immunisées par voie sous-cutanée deux fois à un intervalle de trois semaines. Le groupe I (six souris) n'a été soumis à aucun traitement, servant de témoin à blanc pour la surveillance du poids corporel. Le groupe II (30 souris) a servi de groupe de souris non vaccinées qui ont reçu l'adjuvant Montanide ISA 61 VG seul. Le groupe III (30 souris) était composé de souris immunisées deux fois avec 50 μg/souris de protéine de fusion 66NC en mélange avec l'adjuvant Montanide ISA 61 VG. Le groupe IV (30 souris) immunisé avec 50 μg/souris de 74 F et combiné avec l'adjuvant MPL (Sigma Adjuvant System, Shanghai, Chine) à un rapport protéine/volume d'adjuvant de 1:1 et a été utilisé comme sous-unité de contrôle du vaccin21. Des splénocytes et des échantillons de sérum de six souris des groupes II, III et IV ont été récoltés trois semaines après l'immunisation secondaire pour analyse par ELISpot, ELISA et coloration intracellulaire des cytokines afin d'évaluer l'immunogénicité comme décrit ci-après.

Les souris restantes dans chaque groupe (n = 24) ont été provoquées avec 109 unités formant colonie (UFC)/souris de MAP K-10 par injection intrapéritonéale. Six souris par groupe ont été euthanasiées par inhalation de CO2 à 2, 4, 8 et 12 semaines après le défi, et les foies et les intestins ont été prélevés à l'aide de ciseaux stériles, observés et photographiés pour un examen pathologique et divisés en deux parties. Une partie a été utilisée pour le comptage des colonies, tandis que l'autre a été perfusée avec 10 % de formaldéhyde pour l'analyse histopathologique. De plus, des splénocytes et des échantillons de sérum de six souris par groupe ont été prélevés deux semaines après la provocation pour analyser les cytokines intracellulaires et sécrétées, respectivement.

Les réponses immunitaires spécifiques à l'antigène contre 66NC ou 74F ont été évaluées par des tests IFN-γ et IL-4 ELISpot selon Liu J et al. avec des modifications mineures61. Les détails des méthodes sont les suivants. Des lymphocytes spléniques isolés (5 × 105 cellules par puits) ont été ajoutés dans des plaques à 96 puits préenduites avec un anticorps monoclonal anti-IFN-γ ou IL-4 et stimulés à 37 °C pendant 48 h avec 10 μg/mL de fusion 66NC ou 74 F protéine. Le même volume de PBS a été ajouté comme contrôle négatif. Les nombres de splénocytes sécrétant de l'IFN-γ et de l'IL-4 ont été mesurés à l'aide du kit IFN-γ ou IL-4 ELISpot de souris (Dakewe, Pékin, Chine), respectivement, conformément aux instructions du fabricant. Les plaques ont été séchées à l'air et les taches ont été comptées à l'aide d'un iSpot Reader Spectrum (AID, Strassberg, Allemagne).

Les taux d'IgG, d'IgM, d'IgG1 et d'IgG2a spécifiques à l'antigène ont été déterminés par un ELISA traditionnel en sandwich. Des plaques ELISA Costar à 96 puits (Corning, NY, USA) ont été recouvertes de 66NC ou 74 F (500 ng/puits) dans un tampon d'hydrogénocarbonate de sodium (CBS, pH 8,5) à 4 °C pendant une nuit. Ensuite, pour empêcher la liaison protéique non spécifique, du lait écrémé à 5 % a été ajouté à du PBST (0,05 % de Tween-20 dans du PBS, pH 7,4) pendant 2 h à 37 °C. Après trois lavages avec du PBST, des dilutions en série d'échantillons de sérum (le sang a été prélevé dans la veine caudale des souris et centrifugé à 1000 × g pendant 5 min) ont été ajoutées aux plaques ELISA recouvertes d'antigène, qui ont été incubées à 37 ° C pendant 1 h. Après lavage, IgG anti-souris de lapin ou de chèvre conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP) (ab6728)/IgM (ab97230)/IgG1 (ab97240)/IgG2a (ab97245) (dilution 1:10 000 dans PBST, Abcam, Cambridge, MA, USA) ont été utilisés comme anticorps secondaires et incubés à 37 °C pendant 1 h. Enfin, les plaques ont été lavées et un substrat TMB (Sigma-Aldrich, Shanghai, Chine) a été ajouté et incubé pendant 15 min pour le développement de la couleur. La lecture a été effectuée à OD450nm à l'aide d'un lecteur de microplaques ELx808 (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) après avoir ajouté 2 M H2SO4 comme solution d'arrêt. Le titre d'anticorps sériques est la plus grande dilution à laquelle la DO450positive/OD450négative > 2,1.

Des tests de coloration intracellulaire des cytokines (ICS) ont été utilisés pour évaluer les réponses des lymphocytes T CD4 + et CD8 + spécifiques à l'antigène et ont été effectués comme décrit précédemment avec une légère modification61. En bref, 1,5 × 106 splénocytes ont été ensemencés dans une plaque à 6 puits et cultivés à 37 ° C avec une concentration finale de 10 μg / ml de protéine de fusion 66NC ou 74 F. Le même volume de PBS a été ajouté comme contrôle. Après 12 h d'incubation, Golgi-Plug et Golgi-Stop (BD Biosciences) ont été ajoutés. Les cellules ont été incubées pendant 4 h. Les cellules ont été colorées avec un anticorps anti-souris CD4 (12-0041-82) / CD8α (MCD0804) conjugué à PE (1:50, ThermoFisher, Waltham, MA, USA) à 4 ° C pendant 30 min, à l'abri de la lumière. Après deux lavages avec du tampon FACS froid, les cellules ont été fixées et perméabilisées avec du Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), puis lavées deux fois avec du tampon Perm Wash. Les cellules ont été colorées avec de l'anti-IFN-γ conjugué PE/Cy5 (1:50, XMG1.2, ab272255, Abcam), Alexa Fluor 647-conjugué Rat anti-souris IL-17A (1:50, TC11-18H10, 560184 , BD Biosciences), eFluor 450-conjugué anti-Mouse TNF-α (1:50, MP6-XT22, 48-7321-82, ThermoFisher) à 4 ° C pendant 30 min, à l'abri de la lumière. Anticorps PE/Cy5 Rat IgG1 (1:50, RG1, NBP1-43076, Novus Biologicals, Littleton, Co, USA), Alexa Fluor 647 Rat IgG1 (1:50, KLH/G1-2-2, 0116-31, SouthernBiotech , Birmingham, AL, USA) et eFluor 450 Rat IgG1 (1:50, eBRG1, 48-4301-82, ThermoFisher) ont été utilisés conformément aux instructions du fabricant pour le contrôle isotypique. Les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon Perm Wash, remises en suspension dans du PBS, détectées à l'aide d'une cytométrie en flux Apogee A50-Micro Nanoscale (Apogee Flow Systems, Londres, Royaume-Uni) et analysées avec le logiciel Apogee Histogram.

Des échantillons de sérum ont été prélevés à trois semaines d'immunisation post-secondaire et deux semaines après la provocation et comparés à des souris non vaccinées. Selon les instructions du fabricant, les cytokines sériques ont été déterminées par IFN-γ/TNF-α/IL-17A Mouse ELISA Kit (ThermoFisher). De plus, des analyses de régression multiple des niveaux de cytokines sériques et intracellulaires avec des UFC dans le foie et l'intestin ont été effectuées à l'aide des packages R ggplot2 et ggpubr.

Les foies et les intestins de souris MAP-challengées ont été récoltés dans des conditions aseptiques 2, 4, 8 et 12 semaines après la provocation MAP et lavés avec du PBS. Les foies et les intestins ont été photographiés avec un appareil photo numérique (Canon, Tokyo, Japon) pour une analyse macropathologique. La moitié du foie et de l'intestin a été utilisée pour dénombrer les UFC MAP. Ils ont été homogénéisés avec une solution stérile de PBST, suivis de dilutions en série sur des plaques 7H10 contenant 2 mg/L de mycobactine J et incubés à 37 °C pendant 3 à 4 semaines. Et l'autre moitié du foie et de l'intestin ont été fixés par perfusion dans du formol neutre à 10 %, déshydratés, inclus dans des blocs de paraffine et sectionnés pour les colorations acido-résistantes à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) de Ziehl-Neelsen. Les images ont été réalisées par une microscopie Nikon Eclipse E100 (Nikon, Tokyo, Japon). Deux pathologistes indépendants ont quantifié le score des lésions pulmonaires et intestinales en double aveugle. Pour la notation macropathologique, le pourcentage de surface de granulome à la surface du foie a été noté de 0 à 4 à l'aide de l'échelle suivante : 0 = normal (pas de granulome), 1 = légèrement augmenté (< 1 %), 2 = modérément augmenté (≥ 1 % et < 3 %), 3 = fortement augmenté (≥ 3 %), 4 = fortement augmenté (> 3 %) avec des granulomes proéminents. Le nombre de granulomes à la surface de l'intestin a été noté de 0 à 3 en utilisant l'échelle suivante : 0 = aucun granulome, 1 = un granulome, 2 = deux granulomes et 3 = trois granulomes. Pour le cotation histopathologique, la sévérité des lésions hépatiques a été cotée de 0 à 4 selon l'échelle suivante : 0 = normal, 1 = micro-granulomes multiples, 2 = micro-granulomes multiples avec nécrose focale, 3 = macro-granulomes, 4 = macro -granulomes avec nécrose massive. La sévérité des lésions intestinales a été notée de 0 à 3 selon l'échelle suivante : 0 = normal, 1 = microgranulomes multiples, 2 = macro-granulomes, 3 = macro-granulomes et infiltration cellulaire inflammatoire.

L'ANOVA unidirectionnelle et bidirectionnelle a été utilisée pour analyser la signification statistique, suivie des tests de comparaisons multiples de Tukey. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism 9.0.0. La valeur AP < 0,05 était statistiquement significative (*P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ****P < 0,0001).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données associées à cette étude sont présentes dans le document ou les informations supplémentaires. Les ressources, les données et les réactifs de l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

de Silva, K. Développer des vaccins plus intelligents contre la paratuberculose : des premiers biomarqueurs à la conception de vaccins. Immunol. Rév.301, 145-156 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Verteramo Chiu, LJ et al. Un modèle à base d'agents d'évaluation des stratégies de contrôle économique de la paratuberculose dans un troupeau laitier. J. Dairy Sci. 101, 6443–6454 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Losinger, WC Impact économique de la réduction de la production de lait associée à la maladie de Johne sur les exploitations laitières aux États-Unis. J. Dairy Res. 72, 425–432 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lombard, JE et al. Prévalence au niveau du troupeau de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis dans les troupeaux laitiers des États-Unis en 2007. Préc. Vétérinaire. Méd. 108, 234-238 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Botsaris, G. et al. Détection de Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis viable dans les préparations en poudre pour nourrissons par phage-PCR et confirmée par culture. Int J. Microbiol Alimentaire. 216, 91-94 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gerard, ZE et al. Survie de la sous-espèce Mycobacterium avium paratuberculosis dans le lait pasteurisé vendu au détail. Microbiol Alimentaire. 74, 57–63 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Naser, SA, Ghobrial, G., Romero, C. & Valentine, JF Culture de la sous-espèce Mycobacterium avium paratuberculosis à partir du sang de patients atteints de la maladie de Crohn. Lancette 364, 1039-1044 (2004).

Article PubMed Google Scholar

Bitti, ML et al. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis dans une cohorte italienne de patients pédiatriques diabétiques de type 1. Clin. Dév. Immunol. 2012, 785262 (2012).

Google Scholar PubMed

D'Amore, M., Lisi, S., Sisto, M., Cucci, L. & Dow, CT Identification moléculaire de la sous-espèce Mycobacterium avium paratuberculosis chez un patient italien atteint de thyroïdite de Hashimoto et du syndrome de Melkersson-Rosenthal. J. Med. Microbiol. 59, 137–139 (2010).

Article PubMed Google Scholar

Phanse, Y. et al. Un vaccin protecteur contre la maladie de Johne chez les bovins. Micro-organismes 8, 1427 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Knust, B., Patton, E., Ribeiro-Lima, J., Bohn, JJ & Wells, SJ Évaluation des effets d'un vaccin à cellules entières tuées contre Mycobacterium avium subsp paratuberculosis dans 3 troupeaux de bovins laitiers exposés naturellement à l'organisme. Confiture. Vétérinaire. Méd. Assoc. 242, 663–669 (2013).

Article PubMed Google Scholar

Kalis, CHJ, Hesselink, JW, Barkema, HW & Collins, MT Utilisation de la vaccination à long terme avec un vaccin tué pour prévenir l'excrétion fécale de Mycobacterium avium subsp paratuberculosis dans les troupeaux laitiers. Suis. J. Vétérinaire. Rés. 62, 270-274 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

McFadden, J., Collins, J., Beaman, B., Arthur, M. & Gitnick, G. Mycobactéries dans la maladie de Crohn : les sondes ADN identifient la souche de pigeon ramier de Mycobacterium avium et de Mycobacterium paratuberculosis à partir de tissus humains. J.Clin. Microbiol. 30, 3070-3073 (1992).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McFadden, JJ, Butcher, PD, Chiodini, R. & Hermon-Taylor, J. Les mycobactéries isolées de la maladie de Crohn sont identiques à Mycobacterium paratuberculosis, tel que déterminé par des sondes ADN qui distinguent les espèces mycobactériennes. J.Clin. Microbiol. 25, 796–801 (1987).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brujeni, GN & Gharibi, D. Développement d'anticorps IgY aviaires conçus par ADN pour la détection de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis heat shock protein 70 (Hsp70) et anticorps anti-Hsp70 dans le sérum de bovins normaux. Appl. Biochimie. Biotechnol. 167, 14-23 (2012).

Article PubMed Google Scholar

Koets, A. et al. La protéine mycobactérienne de choc thermique de 70 kD est un vaccin sous-unitaire efficace contre la paratuberculose bovine. Vaccin 24, 2550-2559 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Santema, W., Hensen, S., Rutten, V. & Koets, A. La vaccination sous-unité de la protéine de choc thermique 70 contre la paratuberculose bovine n'interfère pas avec les tests immunodiagnostiques actuels pour la tuberculose bovine. Vaccin 27, 2312-2319 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rosseels, V. et al. Les membres de la famille des mycolyl transférases de 30 à 32 kilodaltons (Ag85) provenant du filtrat de culture de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis sont des antigènes immunodominants de type Th1 reconnus tôt lors de l'infection chez la souris et le bétail. Infecter. Immun. 74, 202–212 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mullerad, J. et al. L'immunogénicité de l'antigène 85B de Mycobacterium paratuberculosis. Méd. Microbiol. Immunol. 190, 179–187 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Monreal-Escalante, E. et al. Plantes de luzerne (Medicago sativa L.) exprimant l'antigène 85B (MAP1609c) de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Provoque une immunité de longue durée chez les souris. Mol. Biotechnol. 63, 424–436 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, LH et al. Réponses immunitaires chez la souris à Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis après vaccination avec une nouvelle polyprotéine recombinante 74F. Vaccin 26, 1253-1262 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gupta, SK et al. Le vaccin particulaire auto-assemblé provoque de fortes réponses immunitaires et réduit Mycobacterium avium subsp. infection paratuberculeuse chez la souris. Sci. Rep. 10, 22289 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chandra, S. et al. Réponse immunitaire et efficacité protectrice du vaccin vivant atténué contre Salmonella exprimant des antigènes de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis contre l'épreuve chez la souris. Vaccin 31, 242-251 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kathaperumal, K. et al. Evaluation des réponses immunitaires et de l'efficacité protectrice dans un modèle caprin après immunisation avec un cocktail d'antigènes recombinants et une polyprotéine de Mycobacterium avium subsp. paratuberculose. Vaccin 27, 123-135 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Faccioolo, A. et al. Un modèle d'infection bovine à mycobactéries entériques pour analyser l'immunité mucosale induite par un vaccin parentéral et accélérer la découverte de vaccins. Immunol avant. 11, 586659 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Veazey, RS et al. Comparaison de la résistance des souris C57BL/6 et C3H/He à l'infection par Mycobacterium paratuberculosis. Vétérinaire. Microbiol. 47, 79–87 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bannantine, JP et al. Évaluation de huit candidats vaccins vivants atténués pour la protection contre la provocation par la sous-espèce virulente Mycobacterium avium paratuberculosis chez la souris. Front Cell Infect. Microbiol. 4, 88 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Berry, A., Wu, CW, Venturino, AJ & Talaat, AM Biomarqueurs pour les premiers stades de l'infection et de l'immunisation par la maladie de Johne chez les chèvres. Devant. Microbiol. 9, 2284 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Arsenault, RJ et al. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis inhibe la signalisation induite par l'interféron gamma dans les monocytes bovins : aperçu des mécanismes cellulaires de la maladie de Johne. Infecter. Immun. 80, 3039-3048 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yazdi, AS, Rocken, M. & Ghoreschi, K. Immunologie cutanée : bases et nouveaux concepts. Semin Immunopathol. 38, 3–10 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Basler, T., Geffers, R., Weiss, S., Valentin-Weigand, P. & Goethe, R. Les sous-espèces de Mycobacterium avium induisent l'expression différentielle de médiateurs pro-inflammatoires dans un modèle de macrophage murin : preuves d'une pathogénicité accrue de Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis. Immunobiologie 213, 879–888 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pooley, HB et al. La réponse immunitaire humorale est essentielle pour une protection vaccinale réussie contre la paratuberculose chez le mouton. Vétérinaire BMC. Rés. 15, 223 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, M., Jiang, S. et Wang, Y. Progrès récents dans la production de vaccins sous-unitaires recombinants chez Pichia pastoris. Bioingénierie 7, 155–165 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ugochukwu, AI, Phillips, PWB & Ochieng, BJ Favoriser l'adoption et la commercialisation de vaccins sous-unitaires contre la tuberculose bovine et la paratuberculose : choix politiques et implications pour la sécurité alimentaire. Vaccins (Bâle) 8, 667 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lee, NH et al. Un examen du développement et de la recherche de vaccins pour les animaux industriels en Corée. Clin. Exp. Vaccin. Rés. 1, 18–34 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Langelaar, M. et al. Mycobacterium paratuberculosis heat shock protein 70 comme outil de contrôle de la paratuberculose. Vétérinaire. Immunol. Immunopathol. 87, 239–244 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sechi, LA et al. Immunogénicité et cytoadhérence de l'hémagglutinine de liaison à l'héparine recombinante (HBHA) de Mycobacterium avium subsp. paratuberculose : promiscuité fonctionnelle ou rôle dans la virulence ? Vaccin 24, 236-243 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Langellotti, CA, Pappalardo, JS, Quattrocchi, V., Mongini, C. & Zamorano, P. Induction d'une activité cytotoxique spécifique pour l'herpèsvirus bovin-1 par immunisation à l'ADN avec différents adjuvants. Antivirus. Rés. 90, 134-142 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Liu, RD et al. Caractérisation moléculaire et détermination des propriétés biochimiques de la cathepsine L de Trichinella spiralis. Vétérinaire. Rés. 53, 48 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zafra, R. et al. Efficacité d'un vaccin multivalent contre l'infection à Fasciola hepatica chez le mouton. Vétérinaire. Rés. 52, 13 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barasuol, BM et al. Nouvelles connaissances sur les propriétés fonctionnelles et de réaction croisée des anticorps générés contre les TbpB recombinantes de Haemophilus parasuis. Sci. Rep. 7, 10377 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Stabel, JR Production d'interféron gamma par les cellules mononucléaires du sang périphérique : un outil de diagnostic important pour la détection de la paratuberculose subclinique. J. Vétérinaire. Diag. Investir 8, 345–350 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zeng, G., Zhang, G. & Chen, X. Les cytokines Th1, véritables signatures fonctionnelles de l'immunité protectrice contre la tuberculose ? Cellule Mol. Immunol. 15, 206-215 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sable, SB, Verma, I., Behera, D. & Khuller, GK Vaccins sous-unitaires multicomposants basés sur la reconnaissance immunitaire humaine contre la tuberculose. EUR. Respir. J. 25, 902–910 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lu, LL et al. Un rôle fonctionnel des anticorps dans la tuberculose. Cellule 167, 433–443 e414 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mittrucker, HW et al. Mauvaise corrélation entre les réponses des lymphocytes T induites par la vaccination par le BCG et la protection contre la tuberculose. Proc. Natl. Acad. Sci. ETATS-UNIS. 104, 12434–12439 (2007).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Sugawara, I., Yamada, H., Mizuno, S. & Iwakura, Y. L'IL-4 est nécessaire pour la défense contre l'infection mycobactérienne. Microbiol. Immunol. 44, 971–979 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Alzuherri, HM, Woodall, CJ et Clarke, CJ Augmentation de l'expression intestinale du TNF-alpha, de l'IL-1 bêta et de l'IL-6 dans la paratuberculose ovine. Vétérinaire. Immunol. Immunopathol. 49, 331–345 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Smeed, JA, Watkins, CA, Rhind, SM & Hopkins, J. Profils différentiels d'expression des gènes de cytokines dans les trois formes pathologiques de la paratuberculose ovine. Vétérinaire BMC. Résolution 3, 18 (2007).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Fernandez, M. et al. Sous-ensembles de macrophages dans les lésions intestinales granulomateuses dans la paratuberculose bovine. Vétérinaire. Pathol. 54, 82-93 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ardain, A. et al. Les cellules lymphoïdes innées du groupe 3 induisent une immunité protectrice précoce contre la tuberculose. Nature 570, 528-532 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Coulter, F. et al. Production D'IL-17 à Partir De T Helper 17, De Cellules T Invariantes Associées Aux Muqueuses Et De Cellules Gammadelta Dans La Tuberculose Infection and Disease. Immunol avant. 8, 1252 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Martinot, AJ et al. Efficacité protectrice d'un vaccin atténué Mtb DeltaLprG chez la souris. PLoS Pathog. 16, e1009096 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arteche-Villasol, N. et al. Réponse précoce des macrophages dérivés de monocytes de chèvres vaccinées et non vaccinées contre une infection in vitro par Mycobacterium avium subsp. paratuberculose. Vétérinaire. Rés. 52, 69 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, HE, Park, HT, Jung, YH & Yoo, HS Profils d'expression génique des gènes immunorégulateurs dans le sang total de bovins atteints d'une infection subclinique à Mycobacterium avium subsp. paratuberculose. PLoS One 13, e0196502 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Sweeney, RW Transmission de la paratuberculose. Vétérinaire. Clin. Amérique du Nord. Animation alimentaire. Pr. 12, 305–312 (1996).

Article CAS Google Scholar

Uzonna, JE et al. Efficacité des vaccinations commerciales et de terrain de Mycobacterium paratuberculosis avec l'IL-12 recombinante dans un modèle d'infection expérimentale bovine. Vaccin 21, 3101–3109 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Veazey, RS et al. Histopathologie de souris C57BL/6 inoculées par voie orale avec Mycobacterium paratuberculosis. J. Comp. Pathol. 113, 75–80 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Eamens, GJ, Walker, DM, Porter, NS & Fell, SA Culture fécale regroupée pour la détection de Mycobacterium avium subsp paratuberculosis chez les chèvres. Aust. Vétérinaire. J. 85, 243-251 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Whitlock, RH & Buergelt, C. Manifestations précliniques et cliniques de la paratuberculose (y compris la pathologie). Vétérinaire. Clin. Amérique du Nord. Animation alimentaire. Pr. 12, 345–356 (1996).

Article CAS Google Scholar

Liu, J. et al. Modulation des hiérarchies d'immunodominance de l'épitope des lymphocytes T CD8 + induites par le vaccin à ADN. J. Virol. 80, 11991-11997 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Télécharger les références

Cette étude a été soutenue par le National Key Research and Development Program of China (2021YFD1800403) et la National Natural Science Foundation of China (32002256, 32273005). L'analyse de la littérature est réalisée à l'aide du logiciel Stork (https://www.storkapp.me). La souris noire a été dessinée par Figdraw dans les figures (www.figdraw.com). Nous remercions LetPub (www.letpub.com) pour son aide linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Guanghui Dang, Siguo Liu.

State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention, Division of Bacterial Diseases, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 678 Haping Street, Harbin, 150069, République populaire de Chine

Mingzhu Shao, Ning Cui, Yangyang Tang, Fanruo Chen, Yingying Cui, Guanghui Dang et Siguo Liu

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

GD et SL ont conceptualisé et conçu l'étude, et ils ont rédigé l'article. MS a réalisé les expériences. NC, YT, FC et YC ont participé à des immunisations et infections animales. Tous les auteurs ont examiné et validé le contenu du manuscrit.

Correspondance à Guanghui Dang ou Siguo Liu.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Shao, M., Cui, N., Tang, Y. et al. Un vaccin sous-unitaire candidat induit une immunité protectrice contre la sous-espèce Mycobacterium avium paratuberculosis chez la souris. npj Vaccins 8, 72 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00675-1

Télécharger la citation

Reçu : 07 février 2023

Accepté : 10 mai 2023

Publié: 20 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41541-023-00675-1

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt