Base structurelle pour le développement de l'ampleur du VIH

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2782 (2023) Citer cet article

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La maturation de l'affinité des anticorps permet des réponses immunitaires adaptatives à un large éventail d'agents pathogènes. Chez certains individus, des anticorps largement neutralisants se développent pour reconnaître des agents pathogènes à mutation rapide avec une grande diversité de séquences. La conception de vaccins contre des agents pathogènes tels que le VIH-1 et la grippe s'est donc concentrée sur la récapitulation du processus naturel de maturation par affinité. Ici, nous déterminons les structures des anticorps en complexe avec l'enveloppe du VIH-1 pour tous les membres observés et les états ancestraux du V3-glycane du VIH-1 largement neutralisant ciblant la lignée de cellules B clonale de l'anticorps DH270. Ces structures suivent le développement de l'étendue de la neutralisation à partir de l'ancêtre commun non muté et définissent la maturation d'affinité à haute résolution spatiale. En élucidant les contacts médiés par des mutations clés à différents stades de développement des anticorps, nous avons identifié des sites sur l'interface épitope-paratope qui sont au centre de l'optimisation de l'affinité. Ainsi, nos résultats identifient les goulots d'étranglement sur la voie de la maturation de l'affinité naturelle et révèlent des solutions pour ceux-ci qui éclaireront la conception d'immunogènes visant à provoquer une réponse immunitaire largement neutralisante par la vaccination.

La maturation de l'affinité des anticorps à partir des gènes d'immunoglobuline (Ig) à chaînes lourdes et légères codés par la lignée germinale implique des cycles itératifs d'hypermutation et de sélection somatiques suivis d'une expansion et d'une différenciation des cellules B, conduisant finalement à la neutralisation des agents pathogènes1. L'avènement du séquençage de nouvelle génération à haut débit et des méthodes de suivi du développement d'anticorps a permis une surveillance étroite du processus de maturation d'affinité2,3. Des études approfondies basées sur la structure des anticorps seuls ou des anticorps en contact avec un antigène apparenté ont révélé que les gains d'affinité impliquent l'acquisition de mutations qui améliorent les contacts anticorps-antigène, la complémentarité de forme, la rigidité du paratope et la conformation des anticorps2,4,5,6,7, 8. La maturation implique également une diversification indépendante de l'affinité, qui, ensemble, conduit à un large éventail de solutions potentielles au problème d'optimisation de l'affinité4,9. Les anticorps avec une ampleur de neutralisation peuvent se lier efficacement à l'antigène cible malgré la variabilité de la séquence et constituent une cible majeure de conception de vaccins pour les agents pathogènes tels que le VIH-1, la grippe et le SRAS-CoV-2 et d'autres coronavirus humains10,11,12.

Alors que la grippe et les infections par le SRAS sont généralement éliminées dans un délai relativement court après l'infection, le VIH-1 est une infection chronique qui intègre le génome et la maturation des anticorps entraînant des anticorps largement neutralisants (bnAbs) ne se produit que sur plusieurs années. Définir les voies de maturation des anticorps pour éclairer stratégiquement la conception des immunogènes et permettre l'accélération de ce processus par la vaccination est l'un des principaux objectifs des efforts actuels de vaccination contre le VIH-113. Des anticorps largement neutralisants ont été isolés chez des personnes vivant avec le VIH (PVVIH) et constituent la base de nombreuses stratégies vaccinales visant à induire les bnAbs14. Le développement de bnAb dirigés contre le VIH-1 nécessite généralement un ensemble défini de mutations spécifiquement positionnées dans les paires d'Ig à chaîne lourde/légère pour se produire dans le clone d'anticorps, ce qui représente un formidable défi dans la conception d'immunogènes visant à récapituler le développement de bnAb. Ceci est exacerbé par les caractéristiques bnAb du VIH-1 qui sont rares, notamment des mutations somatiques étendues, des régions déterminant la troisième complémentarité de la longue chaîne lourde (HCDR3), des insertions et des délétions d'Ig, une utilisation restreinte des gènes de la lignée germinale et un enrichissement pour les mutations à faible probabilité15,16,17. Une compréhension détaillée des étapes de maturation d'affinité conduisant au développement de bnAb, y compris la discrimination entre les mutations acquises qui conduisent à la réponse bnAb souhaitée par rapport à celles qui aboutissent à des réponses hors cible moins productives, est donc essentielle pour identifier les déterminants de la cellule B bnAb mûrie par affinité. sélection des récepteurs (BCR).

L'étude de la coévolution des clones de virus et d'anticorps au cours de l'infection par le VIH éclaire la conception des vaccins en définissant les variantes de l'enveloppe du VIH-1 (Env) qui évoluent au cours du développement des bnAb, fournissant ainsi un modèle pour la conception itérative d'immunogènes7,18,19,20. Les cibles des bnAb du VIH-1 sont des épitopes conservés sur la protéine Env21,22,23,24. L'Env du VIH-1 est un trimère d'hétérodimères gp120-gp41 qui sont fortement protégés du système immunitaire de l'hôte par la glycosylation liée à N et en outre protégés de la neutralisation par le masquage conformationnel et une variabilité de séquence considérable.

Une région glycosylée près de la base de la troisième boucle variable (V3) de l'Env du VIH-1 forme un supersite de vulnérabilité qui est ciblé par des anticorps provenant de divers gènes germinaux chez plusieurs individus infectés par le VIH-125. Le développement d'un anticorps V3-glycane largement neutralisant a été étudié chez un homme africain vivant avec le SIDA du Malawi (CH848, clade C), qui a été suivi depuis le moment de l'infection jusqu'à 5 ans après la transmission20. Chez l'individu CH848, l'apparition précoce de deux clones de cellules B neutralisantes "coopérantes" autologues (DH272 et DH475) a conduit à la sélection de variants d'échappement viraux, qui à leur tour ont stimulé le clone DH270 qui s'est ensuite développé pour acquérir une puissante étendue de neutralisation20. La lignée DH270 est dérivée des gènes des chaînes lourdes et légères VH1-2*02 et Vλ2-23, respectivement, avec une longueur de région déterminante complémentaire de chaîne lourde de vingt résidus d'acides aminés20, DH270.6, le membre de la lignée avec la plus grande largeur et puissance, neutralise cinquante et un pour cent d'un panel de pseudovirus multiclade avec une puissance moyenne géométrique d'environ 0,21 µg/ml26. Avec des niveaux de mutation somatique de 12,8 et 6,7 % pour les gènes des chaînes lourdes et légères, respectivement, DH270.6 fait partie des bnAbs26 V3-glycanes les moins mutés. Les anticorps DH270 ont été détectés chez l'individu CH848 à la semaine 186 et ont coïncidé avec l'apparition de variants Env avec une boucle variable raccourcie 1 (V1)20. L'anticorps ancêtre commun non muté DH270 déduit (DH270.UCA), représentant le progéniteur de cellules B naïf du clone DH270, ne neutralise pas le VIH-1 hétérologue, bien qu'un seul changement d'acide aminé en position 57 de la chaîne lourde qui a remplacé une glycine pour une arginine (G57R) a entraîné une neutralisation hétérologue du VIH-1, bien qu'avec une ampleur limitée. Au fur et à mesure que l'affinité du clone DH270 mûrissait et que les anticorps accumulaient des mutations dans leurs régions variables de chaînes lourdes et légères (VH et VL), l'étendue et la puissance de la neutralisation hétérologue s'amélioraient. Les premiers anticorps intermédiaires ancestraux DH270 étaient capables de neutraliser les virus hétérologues avec de courtes boucles V1. La lignée clonale des cellules DH270 B a évolué pour gagner en capacité de neutraliser les virus avec des boucles V1 plus longues, mais avec une puissance réduite20. Une corrélation inverse similaire entre la puissance et la longueur de V1 a été observée pour les autres bnAbs de V3-glycane 10-1074, PGT121 et PGT12827,28. Le riche ensemble de données d'anticorps co-évolutifs et d'Env disponibles pour le clone DH27020 a présenté une opportunité d'étudier les aspects structurels de la maturation d'affinité et de la coévolution du virus à un niveau de détail sans précédent et de définir comment ces informations éclaireront la conception de vaccins visant à obtenir des bnAb ciblant le Supersite V3-glycane.

Trois découvertes clés ont informé notre compréhension actuelle du clone DH270. Premièrement, bien que l'hypermutation somatique soit un processus stochastique, des points chauds et des points froids existent dans la séquence d'anticorps pour les mutations somatiques induites par l'activation de la cytidine désaminase (AID), ce qui entraîne des différences dans les probabilités avec lesquelles les résidus d'anticorps sont mutés. Ceci, combiné au besoin possible de plusieurs changements de base, peut conduire à certaines mutations avec une faible probabilité, définie ici comme moins de deux pour cent. Les bnAb du VIH-1, y compris ceux du clone DH270, sont enrichis pour les mutations clés à faible probabilité17. Deuxièmement, sur les quarante-deux mutations du membre le plus large et le plus puissant de ce clone, seules douze sont nécessaires pour atteindre quatre-vingt-dix pour cent de sa largeur, ce qui nous permet d'identifier les régions les plus critiques de l'anticorps qui doivent être optimisées29. Enfin, clé pour considérer la maturation d'affinité dans le contexte du développement de vaccins, nous avons montré que des immunogènes conçus de manière rationnelle peuvent étendre les précurseurs DH270 bnAb V3-glycanes21.

Ici, nous avons utilisé cryo-EM pour visualiser les interactions d'un arbre clonal DH270 inféré complet avec le virus co-évoluant Env. Nous définissons les défenses montées par le virus pour protéger son épitope V3-glycane pendant l'infection et démontrons comment le clone DH270 s'est développé pour engager d'abord Env, puis a mûri pour contourner efficacement ces barrières afin d'atteindre une ampleur de neutralisation. Nos résultats montrent que le développement de clones impliquait des solutions séquentielles pour gagner en affinité sur des sites de contact anticorps-antigène spécifiques. A chaque stade de développement, l'acquisition d'une solution a été suivie d'un fractionnement du clone en sous-clones distincts conduisant à des gains différentiels d'affinité et d'ampleur de neutralisation. Ces résultats ont montré que les mutations acquises tôt dans le clone déterminaient le sort de la maturation d'affinité clonale DH270 en aval. La maturation des anticorps impliquait une optimisation par étapes, spécifique au site, des contacts épitope-paratope avec le site de déplacement du foyer alors que les mutations évasives s'accumulaient sur la surface antigénique.

Les structures de plusieurs fragments de liaison à l'antigène DH270 (Fabs) ont été précédemment déterminées, y compris les UCA DH270 inférés, ainsi que les anticorps matures DH270.3, DH270.5 et DH270.6 qui ont été isolés de l'individu CH848. De plus, les structures ont été déterminées d'un fragment variable à chaîne unique DH270.1 (scFv), d'un DH270.3 associé au mannose, d'un peptide V3-glycane associé à DH270.6 scFv et d'un ectodomaine Env soluble lié à DH270 UCA et DH270.6 Fabs20 ,21,30. Alors que la structure DH270.6 associée au V3-glycane a clarifié le rôle des résidus individuels critiques pour la largeur de neutralisation, elle n'a pas révélé la voie structurelle sous-jacente à l'évolution de cette largeur, ni montré comment la largeur et la puissance étaient affectées par des mutations dans différents clades DH270 et sous-clades. Nous avons donc cherché à déterminer l'impact des mutations à chaque étape de la maturation en déterminant les structures cryo-EM des Fab membres clonaux DH270 associés à l'Env du VIH-1 à partir de chaque intermédiaire ancestral d'anticorps et de toutes les formes d'anticorps matures (Fig. 1 et Fig. 1 supplémentaires). et 2). Un trimère SOSIP soluble dérivé d'un virus isolé de l'individu CH848 au jour 949 (appelé ici Env d949) après transmission a été utilisé pour préparer des complexes avec les Fab du clone DH270 pour des études structurelles. Cette enveloppe a été sélectionnée pour sa proximité temporelle avec l'apparition de la lignée DH270 chez le patient infecté et parce qu'elle interagit avec tous les membres de la lignée DH270. Avec la constante Env, toutes les différences structurelles observées peuvent être attribuées aux différences d'acides aminés des anticorps. Les résolutions de carte variaient de 5, 3 à 3, 3 Å avec des résolutions locales à l'interface Fab-Env dans la plage de 5 à 3 Å (Figs. 2-4 supplémentaires, Tableaux 1 et 2).

A (en haut à gauche) Un anticorps DH270 Fab lié à l'ectodomaine de l'enveloppe du VIH-1 (Env) mettant en évidence les sous-unités gp120 (bleu) et gp41 (orange). Les chaînes lourdes et légères Fab de l'anticorps sont colorées en rouge et en gris, respectivement, avec des épitopes glycanes représentés en bâton. (à droite) Vues agrandies, de dessus et de côté des contacts paratope-épitope. Les cercles en pointillés indiquent des régions de contact distinctes. (en bas à gauche) Les indicateurs numériques identifient les sites de contact mis en évidence par les cercles en pointillés dans les panneaux à droite. B L'arbre phylogénétique du clone DH270 déduit représentant les cartes cryo-EM déterminées pour chaque membre clonal Fab lié au trimère CH848 d949 (blanc). Les noms des membres clonaux sont colorés en fonction de la couleur Fab de chaque carte. La numérotation noire indique les emplacements des mutations consécutives dans chaque anticorps selon les sites énumérés en A. Les affinités pour les anticorps sur le chemin menant à la forme mature la plus large et la plus puissante, M6, sont indiquées en rose. Les membres clonaux intermédiaires sont désignés par un I tandis que les anticorps matures sont désignés par un M.

La cartographie des mutations du clone DH270 sur les structures cryo-EM a révélé des sites groupés qui sont séquentiellement mutés le long de l'arbre clonal des cellules B (Fig. 1A). Ces clusters ont été cartographiés sur sept sites distincts de contact anticorps/Env : (1) interaction du bras D1 distal de l'Env N332-glycane avec la fente formée entre les segments de chaînes lourdes et légères variables Fab (VH/VL) impliquant la lumière- chaîne complémentaire déterminant la région deux (LCDR2) et la chaîne lourde déterminant la complémentarité région trois (HCDR3), (2) interaction de la base N332-glycane GlcNac avec la région HCDR3 de l'anticorps, (3) contact de la boucle Env V1 et de la motif GDIR/K conservé dans la boucle V3 avec les régions Fab HCDR3 et HCDR2, (4) interaction des bras D de l'Env N156-glycane avec la région charpente de l'anticorps, (5) interaction de la base Env N301-glycane GlcNac- 1 et les résidus autour du motif V3 GDIR/K avec la région Fab LCDR3, (6) contact du point de ramification Env N301-glycane et des bras D avec le site N-terminal Fab LCDR1/VL, et (7) contact du Env N442-glycane avec la région Fab LCDR1 (Fig. 1A). Ensemble, ceux-ci comprennent l'intégralité de la surface interactive disponible pour les anticorps du clone DH270.

Les reconstructions cryo-EM ont été résolues aux interfaces Ab/Env pour permettre la construction de modèles atomiques. Nous n'avons observé aucun schéma clair d'amélioration des résolutions d'interface avec une force d'interaction améliorée. Cela pourrait être dû à la variabilité des ensembles de données cryo-EM, ainsi qu'à des réductions de la stabilité thermique dans la lignée DH270 pendant la maturation d'affinité6.

Des modèles clairs de mutations ont émergé le long de l'arbre clonal DH270 sur les sites interactifs Env décrits ci-dessus, suggérant que le clone DH270 évoluait pour résoudre des goulots d'étranglement structurels séquentiels spécifiques sur la voie de la maturation d'affinité (Fig. 1B). Le premier intermédiaire, I5, a acquis des mutations qui ont renforcé les interactions au niveau des clusters 3 et 6 en améliorant les contacts protéine-protéine ainsi que les interactions de l'anticorps avec le glycane N301, ce qui a entraîné une affinité de liaison améliorée d'environ 8 fois avec le d949 Env par rapport à l'UCA. Après l'intermédiaire I5, le clone se divise en deux chemins distincts le long d'un clade défini par l'intermédiaire I3 et d'un clade défini par l'intermédiaire I4. Cette scission consécutive conduit à l'acquisition d'une plus grande étendue et d'une plus grande puissance de neutralisation dans le clade I3, conduisant au DH270.6 bnAb (Fig. 1B)20. Les deux clades ont acquis des mutations autour du site d'interaction N332-glycane mais à des positions différentes. L'intermédiaire I3 améliore l'interaction avec le bras distal N332-glycane D1 (groupe 1) tandis que l'intermédiaire I4 améliore l'interaction avec la base N332-glycane GlcNac (groupe 2). Chaque intermédiaire se divise ensuite en deux sous-clades, révélant une cible Env conservée pour l'optimisation du contact par trois des quatre anticorps matures/intermédiaires. Ceux-ci incluent l'anticorps mature du clade I4 DH270.3, l'anticorps mature du clade I3 DH270.1 et l'anticorps intermédiaire I2, qui présentent tous plusieurs mutations regroupées dans ou adjacentes à la région LCDR3 de l'anticorps, améliorant vraisemblablement les interactions avec la base Env N301-glycane ( groupe 5). L'anticorps mature DH270.2 du clade I4 a acquis des mutations concentrées sur le groupe 1, améliorant les interactions au niveau du bras N332-glycane D1 d'une manière similaire à l'intermédiaire I3. L'intermédiaire I2 a acquis des mutations supplémentaires au niveau des clusters 3, 4 et 7, avec DH270.6 mature, l'anticorps le plus large et le plus puissant du clone, modifiant davantage les interactions au niveau du cluster 7. Un anticorps DH270 minimalement muté (minDH270) a été conçu29 où seulement 12 des 42 mutations de DH270.6 étaient nécessaires pour atteindre environ 90 % de l'étendue et de la puissance de DH270.6. Il est important de noter que les mutations ne comprenaient que celles apparues dans I5, I3 et I2. Conformément à cette observation, des mutations après I2 se sont produites à des sites plus distaux et leurs effets étaient moins clairs par rapport aux mutations qui sont apparues dans les membres précédents du clone DH270, comme décrit ci-dessous. Les anticorps DH270.5 et DH270.6 ont acquis plusieurs mutations près de l'extrémité N-terminale LCDR1/VL où des interactions avec les bras N301-glycane D peuvent se produire. Les reconstructions cryo-EM dans cette région étaient mal résolues, empêchant une définition précise de ces interactions. Ensemble, ces résultats indiquent que la maturation du clone DH270 impliquait un gain d'affinité séquentiel sur des sites distincts, et que des solutions structurelles spécifiques étaient nécessaires pour le gain d'affinité et le développement de l'étendue de la neutralisation. Ceci est illustré dans la dichotomie où l'acquisition de mutations dans la région LCDR3 de l'anticorps a entraîné un gain de largeur de neutralisation dans DH270.1 et dans l'intermédiaire I2, mais une perte de largeur de neutralisation dans DH270.3.

Nous avons ensuite étudié les arrangements structurels spécifiques sous-jacents à la maturation à chaque étape, en examinant d'abord les mutations de l'intermédiaire I5 ​​(Fig. 2A, B). Nous avons précédemment déterminé les structures de l'UCA DH270 et des Fab DH270.6 matures liés au trimère CH848 d949 Env avec les glycanes de la boucle V1 aux positions 133 et 138 retirés21. Dans la structure liée à l'UCA, la boucle V1 interagit avec l'anticorps, le motif V3 GDIK et les résidus V3 adjacents, tandis que dans l'Env lié à DH270.6, la boucle V1 a été déplacée de cette position de sorte qu'elle n'interagit plus avec le V3 GDIK. motif. Ce déplacement a été attribué à la mutation VH G57R qui se produit dans le premier intermédiaire21. Pour visualiser la conformation de la boucle V1 lorsqu'elle n'est pas liée à un anticorps au niveau de l'épitope bNAb du glycane V3, nous avons déterminé la structure du d949 SOSIP Env en complexe avec l'anticorps du site de liaison CD4 VRC01. Nous avons constaté que la conformation de la boucle V1 non liée ressemblait à celle de la boucle V1 liée à l'UCA (Fig. 6A supplémentaire). Nous avons en outre déterminé la structure de DH270.UCA incorporant la mutation VH G57R en complexe avec le CH848 d949 SOSIP Env (Fig. 2C et Supplémentaire Fig. 6B). La boucle V1 dans la structure UCA + G57R a été déplacée de sa position observée dans ses formes libres et liées à l'UCA où elle interagissait avec et protégeait le motif V3 GDIK (Fig. 6C supplémentaire). Le déplacement de la boucle V1 dans la structure UCA + G57R s'accompagne d'un changement marqué dans l'orientation de l'anticorps, faisant tourner le Fab VH/VL vers l'espace précédemment occupé par la boucle V1, rapprochant l'anticorps de l'Env (Fig. 2C et Fig. 6D supplémentaire). La comparaison de la structure du complexe lié à UCA + G57R avec le complexe lié à I5 a révélé d'autres changements dans l'orientation de l'anticorps orchestrés par les autres mutations acquises dans l'intermédiaire I5. La substitution VL S27Y près du point de branchement β-Mannose du N301-glycane est le coupable probable, modifiant l'orientation du glycane N301 dans le complexe lié à I5 par rapport au complexe lié à l'UCA + G57R (Fig. 2D).

Un arbre clonal DH270 mettant en évidence les anticorps intermédiaires UCA et I5. B Vues de dessus et de côté du site de contact I5. Les carbones alpha (Cα) de mutation des chaînes lourdes et légères sont présentés sous forme de sphères. C Vue de dessus des contacts de la chaîne lourde UCA et UCA+G57R avec gp120 mettant en évidence les changements dans la position de l'anticorps et dans la boucle Env gp120 V1. La représentation de dessin animé en pointillés pour l'Env V1 lié à UCA-G57R relie les résidus 133 et 153 entre lesquels la densité de carte pour V1 est faible. D Carte filtrée gaussienne du complexe trimère lié au Fab UCA + G57R (gris) superposée à une carte filtrée et soustraite du complexe trimère lié au Fab I5 (vert). La localisation de la mutation S27Y sur les cartes est indiquée en orange. E (en haut à gauche) Angle de contact thêta et dièdre phi avec les positions des centres de gravité utilisés pour les calculs indiqués par des sphères. (au milieu à gauche) Alignement (gp120 uniquement) des structures à l'état lié UCA et UCA + G57R mettant en évidence le changement de disposition des anticorps autour de l'angle thêta. (en bas à gauche) Alignement (gp120 uniquement) des structures à états liés UCA + G57R et I5 mettant en évidence le changement de disposition des anticorps autour du dièdre phi. (en haut à droite) Distance entre le centroïde Fab VH/VL de l'anticorps et le centroïde de l'épitope gp120. (en bas à droite) Graphique Theta vs. phi pour les structures UCA, UCA+G57R et I5. Les couleurs des points de données correspondent aux couleurs respectives des chaînes lourdes dans les structures.

Nous avons ensuite quantifié ces changements d'orientation des anticorps à l'aide d'angles vectoriels entre l'anticorps Fv et son épitope gp120. Les centroïdes de l'épitope, le Fv, et un point d'ancrage dans le VH ont été utilisés pour déterminer la distance entre le Fv et son épitope et son angle (thêta), avec un point d'ancrage supplémentaire dans l'épitope ajouté pour examiner la rotation (phi) du anticorps par rapport à l'épitope (Fig. 2E). Thêta et phi décrivent l'angle d'approche des anticorps en référence à l'épitope, permettant une inspection minutieuse des différences dans la disposition des anticorps à mesure que les mutations s'accumulent dans le clone. La distance entre l'anticorps et l'épitope a été réduite d'environ 0, 5 Å dans la structure liée à l'UCA + G57R par rapport à la structure liée à l'UCA, avec d'autres réductions mineures observées dans I5 associées aux mutations I5 supplémentaires (Fig. 2E). La comparaison des dispositions angulaires et dièdres des structures UCA et UCA + G57R a montré une rotation d'environ 2° chacune. L'intermédiaire I5 ​​a montré une rotation supplémentaire autour du dièdre phi dans la direction de la mutation S27Y sans modifications supplémentaires de l'angle de rotation thêta. Ensemble, ces résultats démontrent que les mutations précoces dans le clone DH270 facilitent l'amélioration des contacts, déplacent la position de l'anticorps par rapport à l'Env lié et modifient la conformation de l'Env, en particulier de la boucle V1 et du glycane N301, les changements angulaires et conformationnels renforçant encore interactions anticorps-Env.

Nous avons ensuite examiné le développement précoce de deux clades distincts dans le clone DH270 à partir de l'intermédiaire I5 ​​(Fig. 3A, B). L'intermédiaire I3 qui se produit après I5 dans le clone DH270.6 incorpore les mutations de la chaîne lourde V11M, R87T et l'improbable mutation R98T, et les mutations de la chaîne légère L48Y et S54N. La reconstruction cryo-EM de l'Env lié au Fab I3 a été déterminée à une résolution de 4,5 Å. Le changement conformationnel de la boucle V1 induit par le résidu VH R57 a été conservé, tout comme l'interaction du résidu VL Y27 avec le N301-glycane (Fig. 3B et Fig. 7A, B supplémentaires). Aucune différence majeure n'a été observée dans les sous-unités gp120 et gp41 de la structure Env liée aux Fab I5 et I3 (RMSD ~ 0, 9 Å; Fig. 7C supplémentaire). Comme décrit précédemment30, les mutations VL L48Y et VH R98T introduisent de nouveaux contacts de liaison hydrogène, l'hydroxyle Y48 interagissant avec le N332-glycane, et la libération de D115 par la mutation R98T augmentant le nombre d'interactions de liaison hydrogène D115 avec le N332-glycane (Fig. 3C et Fig. 7D supplémentaire). De plus, la substitution I3 VH R98T a introduit une liaison hydrogène entre les chaînes latérales des résidus T98 et le VH Y27 (Fig. 7E supplémentaire), renforçant ainsi la stabilité interne de la structure de l'anticorps en compensant la perte de l'interaction cation-π de R98. avec Y27. Les mutations VH R87T et VL S54N sont éloignées de la région gp120-interactive de l'anticorps. Un examen attentif des régions locales de ces mutations a suggéré des rôles potentiels de ces substitutions dans l'augmentation de la stabilité interne de l'anticorps. La substitution VH R87T soulage la contrainte électrostatique apportée par trois arginines spatialement regroupées, R67, R85 et R87 (Fig. 3D et Supplémentaire Fig. 7F). Notamment, une deuxième arginine dans ce groupe, R85, est mutée en sérine à l'étape suivante lors de la transition de I3 vers I2. De plus, la chaîne latérale de T87 établit une liaison hydrogène avec l'azote de la chaîne principale du résidu VH D89, augmentant ainsi la stabilité de la structure locale. L'effet de VL S54N était plus subtil, N54 semblant stabiliser l'interaction avec un brin bêta adjacent via une liaison hydrogène de sa chaîne latérale avec la chaîne principale du résidu de chaîne légère 66 (Fig. 7G supplémentaire).

Un arbre clonal DH270 mettant en évidence les anticorps intermédiaires I5, I3 et I4. B Vues de dessus des sites de contact I3 et I4. Les carbones alpha (Cα) des mutations des chaînes lourdes et légères sont présentés sous forme de sphères. C (à gauche) Le contact du bras N332-glycane D1 avec la fente I5 VH/VL. (à droite) Le contact du bras N332-glycane D1 avec la fente I3 VH/VL. D Structure de l'intermédiaire I3 au site R87T près des contacts potentiels N156-glycane. E Domaines I5 et I3 VH alignés mettant en évidence le changement d'angle du coude (magenta). F (à gauche) Carte et coordonnées d'ajustement du nouveau contact N332-glycane formé au site de mutation I4 HCDR3 S108Y. (à droite) Domaines VH I5 et I4 alignés montrant les arrangements de boucle HCDR3.

Les structures des anticorps I5 et I4 étaient similaires et, comme prédit par les simulations de dynamique moléculaire précédentes6, la mutation V11M dans I3 a induit un changement marqué de la charnière du coude Fab de l'anticorps (Fig. 3E). Contrairement à I3, l'intermédiaire I4 n'a pas acquis de mutation du coude et, par conséquent, n'a pas montré de changement distinct dans la région du coude (Fig. 7H supplémentaire). Comme dans I3, le résidu R57 dans I4 a montré des signes de déplacement de la position de la boucle V1 (Fig. 7I supplémentaire). Cependant, une densité supplémentaire a été observée dans cette région, ce qui est cohérent avec une boucle V1 couplée à GDIK, suggérant un comportement multi-états. L'intermédiaire I4 a acquis un plus grand nombre de mutations VH, dont deux dans HCDR3, Y106V et S108Y qui déplacent essentiellement la position de la tyrosine du résidu 106 à 108. Le groupe hydroxyle dans I4 Y108 a formé une liaison hydrogène avec le N332 GlcNac-2 (Fig. 3F à gauche). La conformation du squelette HCDR3 n'a pas été altérée par ces mutations (Fig. 3F à droite). La mutation I4 S84R se situe à proximité des unités de sucre distal N156-glycane. Les densités de la chaîne latérale et de cette partie du N156-glycane n'étaient cependant pas visibles dans la reconstruction cryo-EM (Fig. 7J, K supplémentaires). Les mutations restantes dans la chaîne lourde I4 aux positions G49A, N54T, Q62R et Y116S ne jouent aucun rôle clairement déchiffrable dans l'interaction avec Env ou dans la modification de la structure de l'anticorps. La chaîne légère contient deux mutations non paratopiques, R56W et V100I. Aucun changement n'a été observé autour de la position V100I par rapport à I5 ou I3. Le résidu R59W de la chaîne légère I4 qui est adjacent à la région LCDR2 a présenté un réarrangement modeste qui modifie la position des résidus interactifs N332-glycane distaux (Fig. 7L supplémentaire). Cela n'a pas été associé à des changements apparents dans les interactions des anticorps avec le glycane bien qu'il puisse conférer une stabilisation de la boucle LCDR2 et donc de l'interaction glycane. Ces observations montrent qu'à ce stade de développement, les interactions avec le N332-glycane ont fait l'objet d'une optimisation dans les deux clades de l'arbre clonal DH270.

Le clade I4 conduit aux anticorps matures DH270.2 et DH270.3 (Fig. 4A, B). DH270.2 a montré une plus grande portée et une plus grande puissance que DH270.3, chacun neutralisant dix et quinze membres d'un panel hétérologue de 24 virus, respectivement, bien que les deux aient affiché une portée et une puissance de neutralisation plus faibles par rapport aux anticorps matures du clade I3 qui neutralisent seize à dix-sept membres. du panel hétérologue21. L'alignement des structures liées à Env a révélé des changements distincts dans l'orientation de chaque anticorps par rapport à l'intermédiaire I4 (Fig. 4C et Fig. 8A supplémentaire). L'inspection des angles thêta et phi a indiqué que DH270.3 avait principalement décalé sa rotation autour de l'épitope (Fig. 4D). La mutation la plus notable dans DH270.3 était la réversion de la chaîne légère Y27S. Un net changement dans la position du N301-glycane a été observé par rapport à l'intermédiaire I4 (Fig. 4E et Supplémentaire Fig. 8B). Conformément à la rotation observée de l'anticorps lié dans le complexe I5 / Env par rapport au complexe UCA + G57R / Env, la réversion Y27S a conduit DH270.3 à occuper une orientation correspondant à UCA + G57R (Fig. 4F). Cette inversion de l'orientation des anticorps suggère que la substitution S27Y, acquise pour la première fois en I5, est le moteur de la rotation des anticorps et de la réorientation N301-glycane observée en passant de l'UCA à I5.

Un arbre clonal DH270 mettant en évidence les anticorps intermédiaires I3 et I2 et l'anticorps DH270.1 (M1) mature. B Vues de dessus des sites de contact I2 et DH270.1. Les carbones alpha (Cα) des mutations des chaînes lourdes et légères sont présentés sous forme de sphères. C Alignement (gp120 uniquement) des structures d'état lié I3 et I2 mettant en évidence le changement dans l'arrangement de la boucle V1 de gp120 et le contact entre la chaîne latérale I2 R84 et le N137-glycane. D Alignement (gp120 uniquement) des structures liées UCA et I2 mettant en évidence la similarité conformationnelle entre les boucles gp120 V1. E (à droite) Distance entre le centroïde Fab VH/VL de l'anticorps et le centroïde de l'épitope gp120. (à gauche) Graphique Theta vs. phi pour les structures I3, I2 et DH270.1. Les couleurs des points de données correspondent aux couleurs respectives des chaînes lourdes dans les structures. F Comparaison de la vue latérale du contact de l'épitope de la région LCDR3 entre I3 et I2 mettant en évidence le changement de conformation LCDR3 (flèche magenta). G Comparaison de la vue de dessus du contact de l'épitope de la région LCDR3 entre I3 et I2 mettant en évidence le déplacement du résidu aromatique 93 rotamère (flèche magenta). Alignement H (gp120 uniquement) des structures d'état lié I3 et DH270.1 avec la carte DH270.1 mettant en évidence la mutation Y106S.

Un groupe de mutations, y compris une mutation improbable VH G110Y, se produit dans et autour du DH270.3 LCDR3, près du contact entre une boucle adjacente au motif V3 GDIK et la base N301-glycane GlcNac. Des mutations supplémentaires, F93S, A94T, G95N et S97A, entraînent un remodelage de l'interaction N301-glycane, déplaçant la position de la chaîne latérale LCDR1 Y32 pour l'interaction avec le premier N301-GlcNac et l'interaction de N95 avec le second N301-GlcNac ( figure 4G). En plus du décalage angulaire et des mutations liées à LCDR3, une mutation G103S dans HCDR3 ajoute une liaison hydrogène avec le fragment N332-glycane GlcNac-2 N-acétyle (Fig. 8C supplémentaire). Alors que les mutations DH270.3 optimisaient les interactions avec le N301-glycane, les mutations DH270.2 se concentraient plutôt sur l'interaction N332-glycane du bras D1. Parmi les trois mutations de la chaîne lourde R98K, W101Y et D115N, la mutation D115N a montré le changement d'interaction le plus clair. La perte de la charge négative à D115N a permis à la chaîne latérale de l'asparagine de s'éloigner du K98 chargé positivement d'environ 1,6 Å (D et N Cγ vers R Nε ou K Cε) pour former un vaste réseau de liaisons hydrogène avec le bras N332-glycane D1 (Fig. 4H). Cela reflétait la mutation R98T dans I3, où D115 était libéré de son interaction avec le résidu VH chargé positivement R98 pour engager le N332-glycane. Ensemble, l'analyse des structures DH270.2 et DH270.3 liées à Env suggère que chacune a suivi différentes voies de développement, chacune ciblant des sites distincts. La plus grande largeur de l'anticorps DH270.2 par rapport à DH270.3 est probablement un effet combiné de l'amélioration de l'interaction N332-glycane dans DH270.2 et de la réversion Y27S dans DH270.3.

La prochaine étape de développement dans le clade I3 du clone DH270 a conduit aux gains les plus substantiels d'affinité de liaison à Env (Fig. 1B) et d'étendue de neutralisation du VIH-120. L'intermédiaire I3 se divise en l'intermédiaire I2 et l'anticorps DH270.1 mature, qui acquièrent tous deux des mutations qui se concentrent principalement sur la région LCDR3 (Fig. 5A, B). Une caractéristique notable de la reconstruction cryo-EM du complexe I2-Env est la boucle V1 bien résolue avec une configuration modifiée. Une densité bien résolue a également été observée pour la boucle V1 N137-glycane, qui a contacté le site de mutation S84R de la chaîne lourde I2 (Fig. 5C et Fig. 9A supplémentaire). Cette mutation s'est également produite dans l'intermédiaire I4 qui a montré des densités similaires, bien que moins claires, pour une boucle V1 couplée au motif V3 GDIK. La réorientation de la boucle V1 a déplacé R57 vers le motif GDIK V3, entraînant son interaction avec D325 (Fig. 9B supplémentaire). Cette orientation de la boucle V1 était similaire à la structure du trimère lié à l'UCA avec un coude dans la boucle introduit pour accueillir R57 (Fig. 5D). La quantification de l'orientation de l'anticorps a montré une rotation du I2 VH/VL loin de la boucle V1 pour s'adapter à ce réarrangement de boucle (Fig. 5E).

Un arbre clonal DH270 mettant en évidence l'anticorps intermédiaire I4 et les anticorps matures DH270.2 (M2) et DH270.3 (M3). B Vues de dessus des sites de contact DH270.2 et DH270.3. Les carbones alpha (Cα) des mutations des chaînes lourdes et légères sont présentés sous forme de sphères. C (gauche) Alignement (gp120 uniquement) des structures d'état lié I4 et DH270.2 mettant en évidence le changement de disposition des anticorps (droite) Alignement (gp120 uniquement) des structures d'état lié I4 et DH270.3 mettant en évidence le changement de disposition des anticorps. Diagramme D Thêta en fonction de phi pour les structures I4, DH270.2 et DH270.3. Les couleurs des points de données correspondent aux couleurs respectives des chaînes lourdes dans les structures. E Superposition de structure des glycanes I4 et DH270.3 N301 montrant leur changement de disposition et l'emplacement des résidus S27 ou Y27 sur la chaîne légère de l'anticorps. F Alignement (gp120 uniquement) des structures d'états liés UCA+G57R et DH270.3 indiquant des arrangements d'états liés similaires. G Comparaison du site de contact LCDR3 avec la protéine gp120 et le N301-glycane entre les structures I4 (supérieure) et DH270.3 (inférieure). H Comparaison des contacts d'anticorps du bras N332-glycane D1 entre les structures I4 (supérieure) et DH270.2 (inférieure).

L'intermédiaire I2 et DH270.1 acquièrent tous deux plusieurs mutations modificatrices de LCDR3 comme celles observées dans DH270.3 (Fig. 5F, G et Supplémentaires Fig. 9C, D). Dans DH270.1, plusieurs mutations se sont produites à la base de LCDR3 qui étaient distales par rapport à l'épitope et, ensemble, elles ont probablement stabilisé la région LCDR3 (Fig. 9E, F supplémentaires). Des mutations similaires se produisent dans l'intermédiaire I2, notamment une mutation F101C spatialement adjacente à la base LCDR3 qui entraîne la formation d'une liaison disulfure supplémentaire dans l'anticorps entre les résidus 91 et 101 (Fig. 9D supplémentaire). Cette mutation fait partie de l'ensemble minimal de mutations décrit précédemment nécessaire pour atteindre environ 90 % de l'étendue DH270.629. Un nombre considérable de mutations dans et affectant LCDR3 faisaient également partie de la construction minDH270 et ont des effets distincts sur l'interaction épitopique dans la structure liée intermédiaire I2. Ceux-ci comprenaient les VL Y93F, A94G et S97A qui fonctionnent de concert avec VH G110Y pour provoquer un réarrangement dans la région LCDR3, créant une poche dans laquelle repose la fraction N-acétyle N301 GlcNac-1 (Fig. 5F). Un impact important de la mutation improbable HCDR3 G110Y dans la création de cette poche est le déplacement du rotamère F93 via l'occlusion stérique (Fig. 5G). De plus, une mutation HCDR3 Y106S se produit dans DH270.1 qui a entraîné deux effets. Premièrement, la perte d'une liaison hydrogène entre la chaîne latérale de Y106 avec la chaîne principale de W101 et, deuxièmement, la libération de l'interaction de la chaîne latérale de Y106 avec le glycane N332 ; ensemble, ceux-ci peuvent agir pour moduler l'interaction du glycane N332 avec HCDR3 en lui permettant d'engager plus efficacement la chaîne latérale W101 (Fig. 5H). Ces résultats, ainsi que les changements observés de LCDR3 dans DH270.3, suggèrent que des modifications de l'interaction à ce site étaient essentielles pour la maturation de l'affinité.

À partir de l'intermédiaire I2, le clone se divise en deux voies, aboutissant toutes deux à une ampleur de neutralisation similaire, bien que DH270.6 ait la plus grande puissance (Fig. 6A, B)20. Le chemin supérieur de I2 mène à l'intermédiaire I1 puis aux anticorps DH270.4 et DH270.5 matures. Les mutations dans cette sous-clade I1 étaient généralement plus éloignées de la surface interactive anticorps-antigène avec des impacts structurels moins clairs. Dans I1, deux mutations avec des impacts possibles sur la boucle LCDR2, N62H et R65W, pourraient affecter les interactions du bras N332-glycane D1 (Fig. 6C et Supplémentaire Fig. 10A). Cette boucle était cependant mal résolue, limitant notre capacité à déterminer l'impact éventuel de ces mutations. Dans DH270.4, une mutation VH S85R est positionnée pour une interaction avec le N156-glycane (Fig. 6D et Supplémentaire Fig. 10B). Cependant, comme c'était le cas pour les mutations intermédiaires I1, cette région est mal résolue et l'interaction ne peut donc pas être confirmée. Bien que le bras N301-glycane D n'ait pas été bien défini en densité, les VH et VL de DH270.5 et DH270.6 ont acquis plusieurs mutations à proximité du bras N301-glycane D (Fig. 6E, F et Fig. 10C, D). Des densités cohérentes avec les états de boucle V1 couplés et découplés de V3 GDIK étaient apparentes dans le trimère lié à DH270.6 (Fig. 6H et Supplémentaire Fig. 10E, F). Des mutations supplémentaires dans DH270.6 se sont produites près du N442-glycane et de la configuration de la boucle V1 qui a été déplacée du motif V3 GDIK (Fig. 6G, H). L'examen de ces structures indique que des mutations après I2 se sont produites principalement dans des régions plus distales de l'épitope, ce qui est cohérent avec la capacité de I2 à neutraliser la plupart des virus neutralisés par DH270.6.

Un arbre clonal DH270 mettant en évidence les anticorps intermédiaires I2 et I1 et les anticorps matures DH270.4 (M4), DH270.5 (M5) et DH270.6 (M6). B Vues de dessus des sites de contact I1, DH270.4, DH270.5 et DH270.6. Les carbones alpha (Cα) des mutations des chaînes lourdes et légères sont présentés sous forme de sphères. C Structure des contacts I1 VH/VL avec le bras N332-glycane D1 montrant les positions des mutations VL N62H et R56W. D Structure de la chaîne lourde DH270.4 montrant la position de contact possible entre la mutation S85F et le N156-glycane. E Structure des mutations DH270.5 VH/VL proximales au N301-glycane. F Structure des mutations DH270.6 VH/VL proximales au N301-glycane. G Structure des mutations DH270.6 VL proximales au N442-glycane. La structure H du DH270.6 VH montre deux états différents de la boucle gp120 V1.

Ensemble, la détermination structurelle de l'ensemble du clone DH270 a révélé un processus complexe par lequel l'ampleur de la neutralisation du VIH-1 a été développée dans le clone DH270 dirigé par le supersite V3-glycane, avec des mutations précoces improbables G57R et S27Y de l'orientation de l'anticorps I5 modifiant l'orientation et conférant une neutralisation hétérologue. largeur. Le développement de deux clades distincts de I5 aux intermédiaires I3 et I4 a entraîné l'acquisition d'améliorations de l'interaction N332-glycane, soulignant davantage l'importance de l'engagement N332-glycane pour le clone DH270. Chacun, cependant, ciblait des sites distincts du glycane, I3 stabilisant le bras D1 distal et I4 stabilisant la base GlcNac. La maturation en aval de I4 à DH270.2 suggère que ce n'était pas une solution idéale pour acquérir l'interaction N332-glycane, car DH270.2 acquiert des mutations comme celles de I3 pour le bras N332-glycane D1. Post-I3, conduisant à I2 et DH270.1 avec DH270.3, montrent tous un nombre considérable de mutations dans le LDCR3 et les résidus adjacents. Alors que DH270.3 acquiert plusieurs mutations critiques pour la neutralisation, notamment G110Y et S94A, la sélection de la réversion Y27S peut avoir limité son ampleur. Là où DH270.1 a acquis des mutations stabilisantes de LCDR3, I2, qui a développé une ampleur de neutralisation considérable, a modifié la conformation de LCDR3, stabilisant un point de contact de base N301-glycane. Cela a été médié par au moins cinq résidus, dont chacun seul peut avoir fourni un gain d'affinité limité. Dans le cas de DH270.3, s'il avait d'abord stabilisé le bras N332-glycane D1, les gains limités associés à l'optimisation du site LCDR3 auraient pu être traitables. Les modifications paratopiques en aval de l'intermédiaire I2 étaient éloignées de l'épitope primaire et ont probablement agi pour affiner l'affinité, l'étendue et la puissance. L'anticorps minDH27029 ne nécessitait que des mutations de I5 à I2, conformément à cette observation. Ces résultats montrent que la sélection pendant la maturation d'affinité peut être réduite à une série de goulots d'étranglement structurels avec le clone d'anticorps en développement démontrant des solutions optimales et sous-optimales lorsque le clone se divise en chemins distincts.

L'évolution de l'étendue de la neutralisation du VIH-1 dans le clone DH270 s'est produite dans le contexte d'une co-évolution avec le virus, avec des changements clés dans la protéine Env entraînant la maturation des anticorps, et vice versa20. Nous avons d'abord examiné comment l'épitope DH270 a évolué au cours de l'infection chez l'individu infecté par le VIH-1 CH848 (Fig. 11 supplémentaire). Les premiers anticorps du clone DH270 sont apparus entre 793 et ​​1304 jours après l'infection, coïncidant avec une réduction de la longueur de la boucle Env V1 de 18 à 19 acides aminés et une substitution G300N dans Env à un emplacement proche de l'épitope DH270 apparu au jour 699 après -infection (Fig. 7A). Les premiers intermédiaires I5 et I3 ne reconnaissent que les Env qui abritent ces boucles V1 plus courtes et la mutation G300N. Conformément à la sélection d'Env pilotée par les anticorps clones DH270 antérieurs I5 et I3 (Fig. 12A supplémentaire), les virus autologues avec des boucles V1 plus longues et G300 réémergent 1304-1431 jours après l'infection. La capacité du clone DH270 à neutraliser les virus avec à la fois des longueurs de boucle V1 plus longues et G300 apparaît au niveau de l'intermédiaire I2 (Fig. 7A, Fig. 12 supplémentaire). La reconnaissance des boucles V1 plus longues et des mutations du résidu 300 dans les quasi-espèces CH848 se reflète également dans la reconnaissance des anticorps DH270 des virus hétérologues présentant ces caractéristiques, contribuant à l'élargissement de I2 et DH270.6 par rapport à I5 et I320.

Une chronologie de la coévolution des anticorps et des Env. Les cases supérieures indiquent si les Env à chaque instant sont sensibles (vert) ou résistantes aux intermédiaires précoces (supérieur) et intermédiaires ultérieurs/membres clonaux matures (inférieur). Les périodes d'infection au cours desquelles les longues boucles V1 sont dominantes sont affichées en gris avec des points de temps de mutation clés sont mis en évidence le long de l'axe de la chronologie. Les structures Env ont été déterminées pour les séquences isolées aux jours 358, 526, 836 et 949 après l'infection mises en évidence sur l'axe de la chronologie avec la période à laquelle le clone D270 est apparu en surbrillance. B (à gauche) Vue latérale d'un seul protomère gp120/gp41 mettant en évidence le motif V1 et V3 GDIR/K. (à droite) Structures de boucle V1 de chaque isolat Env. C (à gauche) Vue de dessus d'un seul protomère gp120/gp41 mettant en évidence le motif V1 et V3 GDIR/K. Les cartes et la structure correspondent aux structures d358 sans ligand (au milieu à gauche), d949 sans ligand (au milieu à droite) et d949 liées à I3 (à droite). D Les structures liées I3 (à gauche) et I2 (à droite) montrant une similarité dans la conformation de l'épitope. E La structure d526 liée au DH270.6 (à gauche) et la structure d949 liée au DH270.6 (à droite) montrant une similarité dans la conformation de l'épitope.

Sur la base de ces deux caractéristiques de résistance intermédiaire précoce, nous avons sélectionné Envs des jours 358 et 526, ayant à la fois G300 et de longues boucles V1 hypervariables de 18 et 28 acides aminés, respectivement, et Envs des jours 836 et 949, ayant à la fois N300 et V1 hypervariable court. boucles de 11 acides aminés, pour identifier les obstacles structurels à l'interaction des anticorps DH270. Nous avons d'abord examiné la liaison des anticorps clones à chaque ectodomaine Env SOSIP par ELISA (Fig. 13 supplémentaire). Conformément aux observations précédentes, l'UCA n'a affiché qu'une liaison à la construction d949 avec I5 liant les constructions d949 et d836. Alors que 13 présentait une liaison à la construction d358, 14 ne le faisait pas. Conformément aux différences dans la maturation précoce de ces clones, les anticorps DH270.2 et DH270.3 matures se sont liés plus faiblement à la construction d358 par rapport à I2, I1 et DH270.4-6. Ni DH270.2 ni DH270.3 ne se sont liés à la construction d526 alors qu'une liaison mesurable à I2, I1 et DH270.4-6 a été observée, bien que l'interaction ait été plus faible qu'avec les trois autres constructions. Malgré une faible similarité de séquence, l'examen des régions de la boucle V1 de chaque structure Env sans ligand a démontré un noyau hydrophobe structurellement conservé et une liaison hydrogène variable et/ou une formation de pont salin qui assure le couplage de la boucle V1 au motif V3 GDIR/K. Le d358 Env V1 présentait un désordre considérable dans une partie de la boucle avec des interactions flanquantes hydrophobes et de pont salin garantissant que la boucle restait fermée sur le motif V3 GDIR / K (Fig. 7B et Fig. 14A supplémentaire). Le d526 Env contenait un noyau hydrophobe similaire et affichait plus d'ordre malgré sa plus grande longueur. Cela était dû à une interaction directe de la boucle V1 avec le N332-glycane voisin (Fig. 7B et Fig. 14B supplémentaire). Les Env V1 d836 et d949 étaient nettement plus courts mais conservaient toujours la position couplée au noyau hydrophobe et au motif V3 GDIR / K des virus antérieurs (Fig. 7B et Fig. 15 supplémentaire). La boucle d836 présentait un pli dans la boucle près du motif V3 GDIR/K conduisant à une exposition un peu plus importante du motif (Fig. 7B et Fig. 15C supplémentaire). Ensemble, ces résultats indiquent un rôle partagé du V1 pour protéger le motif V3 GDIR/K sensible à la neutralisation qui est médié par un noyau hydrophobe conservé.

Nous avons ensuite examiné l'effet sur l'épitope DH270 de la substitution Env G300N qui est associée à l'initiation du clone. Le motif V3 GDIR/K est proximal à la position 300, formant une structure secondaire de feuillet bêta brisée appariée. L'inspection visuelle du motif V3 GDIR / K dans les cartes d358 et d526 Env contenant du G300 a suggéré un plus grand désordre dans la structure de la feuille brisée par rapport à celle des cartes d836 et d949 Env contenant du N300 (Fig. 7C). N300 a formé un contact de liaison hydrogène avec le squelette I326 du motif V3 GDIK à l'état non lié. Cette interaction est conservée dans les structures à l'état lié pour les intermédiaires précoces avec peu de changement dans la conformation du motif V3 GDIK (Fig. 7C). Ces résultats suggèrent que le G300N a stabilisé l'épitope DH270 permettant à l'UCA et aux intermédiaires précoces de se lier et de neutraliser le virus. Des mutations au niveau du résidu N300 commencent à se produire 1431 jours après l'infection (Fig. 11 supplémentaire), moment auquel les variants de glycine et de tyrosine co-circulent avec les variants d'asparagine. Cela se produit à peu près au moment où les mutations LCDR3 proximales au résidu Env 300 se produisent dans I2, DH270.1 et DH270.3, suggérant le virus en évolution sélectionné pour ces mutations dans le clone. La comparaison des structures I3 et I2 liées à Env a indiqué peu de changement global dans leur configuration d'épitope (figure 7D). De plus, les structures de DH270.6 liées à d526 Env contenant G300 et d949 Env contenant N300 montrent peu de changements dans la conformation globale de l'épitope (Fig. 7E et Supplémentaire Fig. 14B). Comme l'effet principal des mutations LCDR3 était la rigidification du LCDR3 et un contact plus étroit avec la base N301-glycane, avec peu de changement dans la configuration de l'état lié dans les états non ligands ou liés, ces mutants ont probablement amélioré l'interaction en compensant la flexibilité accrue de l'épitope. . Des sites Env coévolutifs supplémentaires en dehors de la boucle V1 et de la position 300 comprenaient les positions 325 à 327 dans le motif 324GDIR / K327 et la position 328 (Fig. 11 supplémentaire à droite). Des mutations se sont également produites qui ont éliminé les séquons glycanes N301, N332 et N442 à partir de 1304 jours après l'infection. Les virus autologues qui étaient résistants au DH270.4 mature étaient principalement enrichis pour la substitution D325N, mais présentaient également une perte de glycanes à 301, 332 et/ou 442. Un impact structurel clair pour D325N n'a pas été observé alors que les contacts étroits dans tous les structures avec les glycanes suggèrent que leur perte aurait en effet des impacts majeurs sur la liaison de l'anticorps DH270. Ensemble, ces résultats montrent que l'évolution du virus a initié l'évolution clonale de DH270 en stabilisant l'épitope GDIR/K via G300N et en supprimant la longue protection de la boucle V1 du motif conservé de la boucle V3 V3 GDIR/K. Le retour de ces caractéristiques protectrices a probablement stimulé la maturation du clone vers la stabilisation du paratope pour lutter contre une flexibilité accrue, entraînant une plus grande ampleur de neutralisation.

Ici, nous avons étudié une série de structures cryo-EM et les avons corrélées avec le résultat de l'affinité des anticorps dans un prototype de clone de cellule B d'anticorps V3-glycane du VIH-1 largement neutralisant. Nous avons démontré les mutations précoces G57R et S27Y nécessaires à l'acquisition d'une largeur hétérologue par l'orientation de l'anticorps altérée par l'anticorps intermédiaire I5 ​​par rapport à Env, et ce changement de position de l'anticorps a probablement affecté le développement d'anticorps en aval. Les prochaines étapes de la maturation par affinité de DH270.6 consistaient à optimiser les interactions avec le N332-glycane avec les intermédiaires I3 et I4 acquérant des mutations autour de l'interaction N332-glycane, bien que ciblant différents bras du glycane ramifié. La maturation de I4 en DH270.2 impliquait l'acquisition de mutations proximales du bras N332-glycane D1 comme celles de I3, ce qui suggère que l'engagement du bras D1 plutôt que du bras D2/3 était une meilleure solution pour optimiser l'interaction N332-glycane. Si DH270.2 montre que la sélection I4 n'était pas idéale, DH270.3 montre le problème de passer trop tôt d'un moment critique. Après I3, le développement vers I2 et DH270.1 avec DH270.3 a tous montré un nombre considérable de mutations dans le LDCR3 et les résidus adjacents, I2 acquérant la plus grande ampleur et puissance de neutralisation. La modification du paratope en aval de l'intermédiaire I2 est apparue plus loin de l'épitope primaire et a probablement agi pour affiner l'affinité, l'étendue et la puissance. Ces résultats ont montré que le développement par étapes et spécifique au site déterminait le sort de la maturation d'affinité clonale DH270 en aval.

Une étude récente d'un clone de cellule B d'anticorps ciblant l'hémagglutinine grippale largement neutralisante a suggéré que la maturation par affinité implique le développement d'un pool diversifié de solutions potentielles à partir desquelles une optimisation supplémentaire pourrait induire une réponse large4. Conformément à cette étude, nous avons constaté ici que différentes mutations résolvaient des problèmes similaires présentés par l'agent pathogène. Cependant, ces solutions n'étaient pas nécessairement aussi efficaces et le clone en développement semblait évoluer vers des solutions optimales pour gagner en affinité, comme en témoigne la similitude des mutations de clade. Ce qui soutient cette hypothèse de "pluripotence" des anticorps développée sur la base d'un bnAb4 de la grippe crée un problème épineux pour la conception des vaccins. Comme des paramètres spécifiques dans les clones sont souhaités pour leurs propriétés d'étendue et de puissance, une direction prudente des réponses en développement vers ces paramètres et loin des solutions moins productives pour l'étendue de la neutralisation sera probablement nécessaire.

Nos résultats ont indiqué que les solutions aux problèmes d'appariement épitope-paratope, plutôt que de se produire ensemble, ont entraîné une diversification du clade. Vu du point de vue de l'ensemble du clone DH270, l'incapacité à acquérir une solution optimale limite la poursuite de la maturation d'affinité comme ce fut le cas pour les membres clonaux DH270.1 et DH270.3. Ainsi, le fait de ne pas acquérir de solutions optimales pour la reconnaissance de l'antigène sur des sites problématiques spécifiques au début de la maturation de la lignée bnAb peut entraver l'ampleur de la neutralisation du développement favorable chez les membres ultérieurs de la lignée. Dans le cadre du clone DH270, une vaccination n'induisant pas la sélection des mutations I5 G57R et S27Y peut limiter l'acquisition des mutations I3 R98T et L48Y. De plus, nos résultats ont démontré comment le clone DH270 a pris des chemins différents pour arriver à des solutions qui différaient considérablement dans l'étendue de la neutralisation du VIH-1. Savoir quels sites épitopiques peuvent être impliqués dans la sélection de mutations avec une meilleure ampleur de neutralisation nous permettra de mieux sélectionner avec précision les modifications immunogènes qui produiraient un gain d'affinité différentiel positif favorisant la ou les mutations souhaitées. Contrairement à I3, qui contenait deux mutations critiques susceptibles d'entraîner un gain d'affinité individuellement, I2 a acquis plusieurs mutations LCDR3 qui ont travaillé ensemble pour modifier l'interaction avec l'Env. La nécessité d'induire de multiples mutations qui peuvent faire peu pour améliorer l'affinité individuellement nécessitera probablement de réfléchir au-delà des propriétés immunogènes aux problèmes liés à l'adjuvant, au moment de la vaccination, ainsi qu'au nombre et à l'identité des immunogènes stimulants.

Bien que notre étude se concentre sur la voie de maturation d'un seul clone de bnAb ciblant le V3-glycane, plusieurs similitudes existent entre divers anticorps ciblant le V3-glycane. Alors que les détails spécifiques de leurs voies de maturation peuvent différer, les anticorps ciblant ce site doivent contourner des barrières structurelles similaires pour arriver à des solutions optimales pour acquérir une ampleur de neutralisation hétérologue. Parmi ces barrières structurelles, les principales comprennent la boucle V1 que les anticorps en développement doivent contourner pour accéder au motif conservé V3 GDIR/K, et les épitopes glycanes, principalement le N332-glycane. En effet, la capacité à reconnaître simultanément ces deux motifs structuraux définit un V3-glycane bnAb ou un précurseur. Le clone DH270 démontre que ces sites épitopiques sont engagés tôt dans le développement clonal avec l'UCA DH270 déjà dans une orientation qui englobe le N332-glycane, la prochaine étape du développement étant l'acquisition de la mutation VH G57R pour engager le V3 GDIK motif. Par conséquent, l'orientation de l'anticorps entre crochets dans le motif V3 GDIR/K et le N332-glycane, même pendant les premiers stades du développement clonal où aucune ou peu d'étendue de neutralisation ne peut être observée, est une signature structurelle clé d'un anticorps V3-glycane qui peut se développer pour acquérir une largeur de neutralisation hétérologue. Cela contraste avec d'autres anticorps autologues ciblant l'apex de l'Env du VIH-1 dans l'espace proximal qui engagent le motif V3 GDIR/K mais pas le N332-glycane31,32,33.

De nouvelles preuves suggèrent qu'un vaccin efficace contre le VIH-1 nécessitera l'induction d'une réponse bnAb polyclonale ciblant plusieurs sites Env de vulnérabilité26. Une voie pour réaliser cette tâche difficile consiste à concevoir des immunogènes capables de sélectionner des mutations bnAb connues dans les lymphocytes B précurseurs de la lignée germinale. La cartographie du développement des anticorps bnAb dans cette étude fournit une feuille de route pour un tel développement d'immunogènes de précision basé sur des clones. En isolant des éléments structurels distincts à l'interface anticorps-antigène, des sites de gain peuvent être établis et des immunogènes peuvent être développés pour résoudre séquentiellement les problèmes structurels associés à chaque site individuellement. En mettant l'accent sur des étapes spécifiques et gérables, la conception d'affinité rationnelle peut passer par une série de cibles bien définies plutôt que d'essayer de mettre en œuvre un ensemble spéculatif de conceptions d'immunogènes finaux manquant de données claires.

L'inférence statistique joue un rôle clé dans notre examen de l'anticorps de la lignée DH270 et de la co-évolution CH848 HIV-1 Env. La reconstruction de l'arbre clonal d'anticorps utilise une inférence statistique basée sur la vraisemblance maximale pour estimer les séquences d'anticorps des nœuds internes représentant les états ancestraux du clone de cellule B et la précision de cette méthode est limitée par les données de séquence disponibles échantillonnées pour le clone et le modèle évolutif utilisé. En tant que tel, l'arbre clonal du clone DH270 utilisé ici et dans d'autres études8,34, représente la meilleure estimation compte tenu des paramètres par défaut du programme Cloanalyst35 et des données de séquence des 6 paires de chaînes lourdes et légères du clone DH270 récupérées par l'antigène- tri spécifique des cellules B uniques. Notre analyse longitudinale de la séquence Env dépend également de l'inférence statistique et de la relation entre la neutralisation du virus membre de la lignée clonale et la probabilité qu'une caractéristique Env particulière soit sélectionnée pour les changements d'anticorps qui améliorent la respiration. Nos rapports sur les effets structurels des mutations des anticorps de la lignée DH270 et les effets spécifiques des mutations Env dans le contexte de la co-évolution dépendent donc de la véracité de ces inférences. De plus, la séquence Env exacte qui a initié la lignée et le nombre de séquences différentes qui ont conduit au développement de la lignée clonale DH270 ne sont pas connus.

Alors que des changements dans le virus et le clone d'anticorps se sont produits simultanément au cours de la co-évolution naturelle, la plupart de nos observations structurelles reposent sur l'utilisation d'un seul Env, qui est un trimère SOSIP soluble dérivé d'un virus isolé de l'individu CH848 au jour 949 après transmission. Bien que cela ait empêché une réplique structurelle fidèle du processus de co-évolution, cela nous a permis de garder l'ensemble de données gérable tout en glanant des informations significatives sur la co-évolution en nous concentrant sur des changements spécifiques de résidus Env qui ont été déterminants dans l'émergence de la résistance et dans la conduite. évolution des anticorps. Notre stratégie nous a permis d'étudier les effets des changements de résidus d'anticorps sans être confondus par des changements simultanés dans Env. Enfin, nous avons ajouté d'autres informations sur la co-évolution en étudiant certaines Env avec des propriétés de neutralisation différentielles et des barrières structurelles à l'engagement des anticorps qui se sont produites à différents moments.

Les cellules Expi293 (ThermoFisher Cat No. A14527) ont été diluées à un volume final de 0,5 L à une concentration de 2,5 × 106 cellules mL-1 dans du milieu Expi293. Quatre cents microgrammes de plasmide de chaîne lourde et de chaîne légère ont été complexés avec de l'Expifectamine (ThermoFisher Cat No. A14526) et ajoutés aux cellules Expi293. Au cinquième jour, les cellules ont été éliminées du milieu de culture cellulaire de transfection par centrifugation et filtration à 0, 8 μM. Le surnageant contenant l'anticorps recombinant a été incubé avec une résine de protéine A (ThermoFisher) pendant une nuit à 4 °C. La résine de protéine A a été recueillie par centrifugation et le surnageant de culture a été éliminé. La résine a été lavée avec 25 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant un total de 340 mM de NaCl. Un total de 30 ml de glycine 10 mM pH 2,4, NaCl 150 mM ont été utilisés pour éluer l'anticorps de la résine de protéine A. Le pH de la solution d'anticorps éluée a été porté à environ 7 par addition de Tris 1 M pH 8,0. La solution d'anticorps a été échangée avec un tampon dans du PBS avec des cycles successifs de centrifugation, filtrée et stockée à -80 ° C.

La production d'enveloppe CH848 SOSIP gp140 a été réalisée avec des cellules Freestyle293 (ThermoFisher Cat No. R79007). Le jour de la transfection, Freestyle293 a été dilué à 1,25 × 106 cellules/mL avec du milieu Freestyle293 frais jusqu'à 1 L de volume total. Les cellules ont été co-transfectées avec 650 μg d'ADN plasmidique exprimant SOSIP et 150 μg d'ADN plasmidique exprimant la furine complexé avec 293Fectin (ThermoFisher Cat No. 12347019). Au jour 6, les surnageants de culture cellulaire ont été récoltés par centrifugation de la culture cellulaire pendant 30 min à 3500 tr/min. Le surnageant acellulaire a été filtré à travers un filtre de 0, 8 μm et concentré à moins de 100 ml avec une cassette de filtration à flux tangentiel à usage unique et à nouveau filtré à 0, 8 μm. La protéine Env trimérique a été purifiée par chromatographie d'affinité avec l'anticorps monoclonal PGT145. La résine couplée au PGT145 a été conditionnée dans une colonne Tricorn (GE Healthcare) et stockée dans du PBS additionné d'azoture de sodium à 0, 05%. Le surnageant acellulaire a été appliqué sur la colonne à 2 ml/min à l'aide d'un AKTA Pure (GE Healthcare), lavé et la protéine a été éluée de la colonne avec 3M MgCl2. L'éluat a été immédiatement dilué dans du Tris 10 mM pH 8, filtré à 0,2 μm et concentré jusqu'à 2 ml pour la chromatographie d'exclusion stérique. La chromatographie d'exclusion stérique a été réalisée avec une colonne Superose 6 16/600 (GE Healthcare) dans Tris 10 mM pH 8, NaCl 500 mM. Les fractions contenant la protéine Env trimérique du VIH-1 ont été regroupées, filtrées de manière stérile, congelées instantanément et stockées à -80 ° C.

Les courbes de liaison SPR des Fabs des lignées DH270 contre CH848 DS SOSIP Trimer ont été obtenues à l'aide d'un instrument Biacore S200 (Cytiva) dans du tampon HBS-N 1 × ou d'un instrument Biacore 3000 (Cytiva) dans du PBS 1 × pH 7,4. Pour les mesures d'affinité DH270 Fabs I5.6, I3.6, I2.6 et DH270.6, le CH848 DS SOSIP Trimer biotinylé a été immobilisé sur une puce de capteur CM3 via de la streptavidine à un niveau de 280 à 290 RU. En utilisant le type d'injection à cycle unique, six injections séquentielles des Fab dilués de 50 à 1500 nM ont été injectées sur le SOSIP Trimer immobilisé à 50 µL/min pendant 120 s par concentration suivies d'une période de dissociation de 600 s. Les Fab ont été régénérés avec une impulsion de 20 s de NaOH 25 mM à 50 µL/min. Les résultats ont été analysés à l'aide du logiciel d'évaluation Biacore S200 (Cytiva). Une surface de streptavidine vierge ainsi qu'une liaison de tampon ont été utilisées pour la soustraction à double référence afin de tenir compte de la liaison d'anticorps non spécifique et de la dérive du signal. Des analyses d'ajustement de courbe ont été effectuées à l'aide du modèle de Langmuir 1:1 avec un Rmax local. Pour DH270UCA3 Fab, le CH848 DS SOSIP Trimer biotinylé a été immobilisé sur un capteur CM5 via de la streptavidine à un niveau de 290 à 300 RU. DH270UCA3 Fab a été dilué de 500 à 3000 nM et chaque concentration a été injectée sur la surface SOSIP Trimer pendant 300 s en utilisant le type d'injection K-inject à 50 µL/min. Une période de dissociation de 600 s a été suivie d'une régénération de surface avec une impulsion de 20 s de NaOH 50 mM. Les résultats ont été analysés à l'aide du logiciel d'évaluation BIA (Cytiva). Une surface de streptavidine vierge et une liaison au tampon ont été utilisées pour la soustraction à double référence. L'analyse d'ajustement de courbe de DH270UCA3 Fab a été réalisée à l'aide du modèle de Langmuir 1: 1 avec un Rmax local. Les courbes de liaison rapportées pour tous les Fab sont représentatives d'un ensemble de données.

Les complexes trimères CH848 SOSIP ont été préparés en utilisant une solution mère de 2 mg/ml de trimère incubée avec un excès molaire six fois supérieur de Fab. Pour éviter l'interaction des complexes trimères avec l'interface air-eau lors de la vitrification, les échantillons ont été incubés dans 0,085 mM de n-dodécyl β-D-maltoside (DDM). Les échantillons ont été appliqués sur des grilles de carbone trouées QUANTIFOIL nettoyées au plasma (EMS, R1.2/1.3 Cu 300 mesh) suivies d'une période d'adsorption de 30 s et d'un transfert avec du papier filtre. La grille a ensuite été congelée en plongée dans de l'éthane liquide à l'aide d'un congélateur en plongée EM GP2 (Leica, 90-95 % d'humidité relative).

L'imagerie Cryo-EM a été réalisée sur un microscope FEI Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) fonctionnant à 300 kV. Les images de collecte de données ont été acquises avec un détecteur direct d'électrons Falcon 3EC ou K3 fonctionnant en mode comptage avec une taille de pixel physique calibrée de 1, 08 Å avec une plage de défocalisation comprise entre −1, 0 et −3, 5 µm à l'aide du logiciel EPU (Thermo Fisher Scientific). Aucun filtre énergétique ou correcteur Cs n'a été installé sur le microscope. Le débit de dose utilisé était d'environ 0,8 e-/Å2 s pour assurer un fonctionnement dans la plage linéaire du détecteur. Le temps d'exposition total était de 60 s et des images intermédiaires ont été enregistrées toutes les 2 s donnant une dose cumulée d'environ 42 e-/Å2 et un total de 30 images par image.

La qualité de l'image Cryo-EM a été surveillée à la volée lors de la collecte de données à l'aide de routines de traitement automatisées. Pour les ensembles de données DH270.I3, DH270.I2, DH270.6, DH270.I4 et DH270.2, le traitement des données a été effectué dans cryoSPARC36, y compris la sélection de particules, plusieurs cycles de classification 2D, la reconstruction ab initio, le raffinement homogène de la carte et la non- raffinement uniforme de la carte. Le reste des ensembles de données a été traité en dehors de cryoSPARC pour améliorer la qualité de la carte, comme décrit ci-après. L'alignement des images du film a été effectué à l'aide de UNBLUR37 et la détermination CTF à l'aide de CTFFIND438. Les particules ont été sélectionnées automatiquement en utilisant un disque gaussien de 80 Å de rayon comme modèle de recherche. Toutes les particules sélectionnées ont été extraites avec une taille de boîte de 384 pixels et réduites à 192 pixels (binning 2) et soumises à 8 cycles de raffinement dans cisTEM39, en utilisant un modèle ab-initio généré avec cryoSPARC36. La distribution des scores attribués à chaque particule par cisTEM a montré une distribution bimodale claire et seules les particules du groupe contenant les scores les plus élevés ont été sélectionnées pour un traitement ultérieur. Le sous-ensemble propre de particules a été réextrait sans binning et soumis à 10 itérations de raffinement local suivies de 5 itérations supplémentaires à l'aide d'un masque de forme généré avec EMAN240. Un raffinement CTF par particule a ensuite été effectué jusqu'à ce qu'aucune amélioration supplémentaire de la courbe FSC ne soit observée. À ce stade, les images de particules ont été réextraites des données brutes et soumises à une correction de mouvement par particule en utilisant toutes les images de film et en appliquant un schéma de pondération de dose basé sur les données41. Les nouvelles particules alignées localement ont été exportées vers cryoSPARC pour effectuer un cycle supplémentaire de raffinement homogène et de raffinement non uniforme.

Pour l'analyse de l'angle du coude avec DH270.I3, I4 et DH270.5, le raffinement de la mise au point locale avec les particules propres après l'expansion de la symétrie a été effectué dans cryoSPARC. Ensuite, les particules ainsi que les paramètres de raffinement correspondants ont ensuite été exportés dans RELION 3.142 pour effectuer une classification 3D sans alignement en utilisant T = 25.

Les structures de chaque anticorps ont été préparées à l'aide de Modeller43 et des structures cristallines Fab disponibles20,30. Les structures SOSIP Env ont été préparées à l'aide d'un modeleur et du trimère CH848 jour 949 lié à DH270.6 (PDB ID 6UM6 chaînes A et B)21. Coordonnées pour VRC01 à partir de l'APB ID 3NGB44 (chaînes H et L). L'ajustement de la structure des cartes cryo-EM a été réalisé dans ChimeraX45 à l'aide de l'application Isolde46. Les statistiques sur l'ajustement de la structure et la qualité de la carte ont été déterminées à l'aide de MolProbity47 et EMRinger48, respectivement. Les glycanes ont été ajustés à l'aide d'une combinaison des cartes filtrées nettes et gaussiennes (écart type de 1, 0 à 1, 5). Des analyses de structure et de carte ont été effectuées à l'aide d'une combinaison de PyMol49 et de ChimeraX avec des angles thêta et phi calculés à l'aide de VMD50. Des cartes de potentiel électrostatique ont été générées dans PyMol.

La liaison de l'anticorps aux protéines SOSIP a été testée en utilisant des plaques ELISA à 384 puits recouvertes de 2 mcg/ml d'anticorps dans du bicarbonate de sodium 0,1 M pendant une nuit à 4 °C. Les plaques ont été lavées avec du PBS/0,05 % de Tween-20 et bloquées avec un diluant de dosage (PBS contenant 4 % (p/v) de protéine de lactosérum/15 % de sérum de chèvre normal/0,5 % de Tween-20/0,05 % d'azide de sodium) à température ambiante pendant 1h. La protéine SOSIP purifiée a été ajoutée dans des dilutions en série de 2 fois à partir de 10 mcg/ml pendant 1 h, suivies d'un lavage. La liaison de SOSIP aux anticorps revêtus a été détectée en utilisant l'anticorps humain biotinylé PGT151 à 0,125 mcg/ml pendant 1 h. PGT151 a été lavé et suivi de streptavidine-HRP (Thermo Scientific # 21130) 1:30 000 pendant 1 h. Les plaques ont été lavées 4 fois et développées avec un substrat TMB (SureBlue Reserve- #5120-0083) suivi de HCl 1M pour arrêter la réaction. Enfin, l'absorbance à 450 nm (OD450) a été déterminée avec un lecteur de plaque 384 puits (Molecular Devices, Spectramax 384 plus).

Les séquences Env utilisées pour l'analyse de signature proviennent de Bonsignori et al.20. L'outil Web AnalyzeAlign de la base de données sur le VIH de Los Alamos a été utilisé pour générer des logos de séquence. Les données de neutralisation autologue proviennent de Bonsignori et al.20. mesuré sur 90 pseudovirus Env autologues, y compris le TF et des Env longitudinaux représentatifs échantillonnés entre 78 et 1720 jours après l'infection. Alors que les intermédiaires de l'étude précédente ont été déduits avec 5 membres clones au lieu de 6 comme dans cette étude actuelle, les intermédiaires I5, I3 et I2 correspondent très étroitement à IA4, IA2 et IA1, respectivement dans Bonsignori et al.20.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les reconstructions Cryo-EM et les modèles atomiques générés au cours de cette étude sont disponibles sur wwPDB et EMBD (www.rcsb.org; http://emsearch.rutgers.edu) sous les codes d'accession suivants : reconstructions Cryo-EM et modèles atomiques générés au cours de cette étude. sont disponibles sur wwPDB et EMBD (www.rcsb.org ; http://emsearch.rutgers.edu) sous les codes d'accès suivants : ID EMD : EMD-40282, EMD-40283, EMD-40285, EMD-40286, EMD -40287, EMD-40288, EMD-40291, EMD-40290, EMD-40289, EMD-40284, EMD-40280, EMD-40280, EMD-40278, EMD-40277, EMD-40275, EMD-40281, EMD-40279 , EMD-40274, EMD-40273 et identifiants PDB : 8SAW, 8SAX, 8SAZ, 8SB0, 8SB1, 8SB2, 8SB5, 8SB4, 8SB3, 8SAY, 8SAU, 8SAU, 8SAS, 8SAR, 8SAQ, 8SAV, 8SAT, 8SAN, 8SAL.

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Les données Cryo-EM ont été recueillies au Duke Krios du Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), membre du North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), soutenu par la National Science Foundation (numéro de prix ECCS-2025064 ) dans le cadre de la National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI), et au National Center for Cryo-EM Access and Training (NCCAT) et au Simons Electron Microscopy Center situé au New York Structural Biology Center, soutenu par le NIH Common Fund Transformative Programme de cryo-microscopie électronique haute résolution (U24 GM129539) et par des subventions de la Fondation Simons (SF349247) et de l'État de New York. Cette étude a utilisé les ressources informatiques offertes par Duke Research Computing (http://rc.duke.edu; NIH 1S10OD018164-01) à Duke University. Nous remercions Advaiti Kane et Parth Patel pour l'analyse de l'antigénicité des trimères. Financement : Ce projet a été soutenu par NIH, NIAID, Division of AIDS Consortia for HIV/AIDS Vaccine Development (CHAVD) Grant UM1AI144371 (BFH), R01AI145687 (PA), NIAID Center for Structural Biology U54AI170752 (PA), NIGMS Grant R01GM141223 (AB) ) et Translating Duke Health Initiative (PA et RCH).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Rory Henderson, Ye Zhou.

Département de médecine et d'immunologie, Duke University School of Medicine, Durham, Caroline du Nord, États-Unis

Rory Henderson, Kevin Wiehe, S. Munir Alam et Barton F. Haynes

Duke Human Vaccine Institute, Duke University School of Medicine, Durham, Caroline du Nord, États-Unis

Rory Henderson, Victoria Stalls, Kevin Wiehe, Kevin O. Saunders, Kara Anasti, Maggie Barr, Robert Parks, S. Munir Alam, Barton F. Haynes & Priyamvada Acharya

Département d'informatique, Duke University, Durham, Caroline du Nord, États-Unis

Ye Zhou et Alberto Bartesaghi

Département de chirurgie, Duke University School of Medicine, Durham, Caroline du Nord, États-Unis

Kevin O. Saunders et Priyamvada Acharya

Biologie théorique et biophysique, Laboratoire national de Los Alamos, Los Alamos, NM, États-Unis

Kshitij Wagh & Bette Korber

Consortium du Nouveau-Mexique, Los Alamos, Nouveau-Mexique, États-Unis

Kshitij Wagh & Bette Korber

Département de pathologie, Duke University School of Medicine, Durham, Caroline du Nord, États-Unis

S. Munir Alam

Département de biochimie, Duke University School of Medicine, Durham, Caroline du Nord, États-Unis

Alberto Bartesaghi & Priyamvada Acharya

Département de génie électrique et informatique, Duke University, Durham, Caroline du Nord, États-Unis

Alberto Bartesaghi

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RH, AB et PA ont dirigé l'étude ; RH, YZ, VS et PA ont déterminé et analysé les structures cryo-EM ; protéines exprimées et purifiées par VS ; KOS a supervisé l'expression et la purification des protéines ; Ks.W. et BK a effectué et analysé les signatures de neutralisation ; KA a effectué des tests SPR ; Essais SPR supervisés par SMA ; MB et RP ont effectué des tests ELISA. RH a écrit et édité le manuscrit avec l'aide de tous les auteurs. BFH et PA ont conçu, édité et obtenu le financement de l'étude. PA a supervisé l'étude et examiné toutes les données.

Correspondance à Rory Henderson, Barton F. Haynes, Albert Bartesaghi ou Priyamvada Acharya.

Les auteurs déclarent les intérêts concurrents suivants : Une demande de brevet couvrant les modifications de l'enveloppe du VIH-1 basée sur cette étude a été soumise par l'Université Duke. Il n'y a aucune restriction d'utilisation scientifique basée sur ce dépôt.

Nature Communications remercie Xueling Wu et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Henderson, R., Zhou, Y., Stalls, V. et al. Base structurelle pour le développement de l'étendue dans la lignée clonale d'anticorps V3-glycane du VIH-1 ciblant DH270. Nat Commun 14, 2782 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38108-1

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Reçu : 10 août 2022

Accepté : 14 avril 2023

Publié: 15 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-38108-1

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